核染色質的DNA片段化是細胞雕亡的標誌。當細胞處於雕亡時,核酸內切酶被激活,選擇性降解染色質DNA,形成50-300 kb的大片段,然後在核小體連接處斷裂,形成180-200 bp或其整數倍的DNA片段。可以從細胞中提取這些DNA片段,通過瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色顯示為DNA梯,因此,可以判斷細胞雕亡的發生。凱基DNA階梯檢測試劑盒提供了壹種簡單快速的提取染色質DNA的方法,增加了DNA小片段的回收率,從而增強了檢測的靈敏度。
操作程序
1.離心收集105~106細胞(1500×g,5min)於1.5mL微量離心管中;
2.用PBS洗滌細胞兩次(離心1500×g 5min ),棄去上清液;
3.向沈澱的細胞中加入100μL裂解緩沖液,在渦旋振蕩器上劇烈振蕩5min,1000×g,離心1000×g,將上清液轉移至另壹個1.5mL微量離心管中;
4.加入100μL裂解緩沖液沈澱,重復上壹步,合並兩次上清液;
5.向合並的上清液中加入20μ l溶液A,然後加入20μ l酶A,在55℃下反應65438±0小時;
6.加入20μ l酶B,37℃65438±0小時;
7.加入130μL沈澱劑和950μL冷乙醇,混勻,在-20℃放置1小時以上或過夜;
8.4℃,12000-14000轉/分離心15-30分鐘,小心棄去上清液,收集沈澱的DNA;
9.加入0.5ml 70%冷乙醇,洗滌DNA沈澱,以12000-14000 rpm離心20min;
10.棄去上清液,室溫幹燥DNA沈澱10 min,加入10-15μL TE緩沖液,充分攪拌溶解DNA;
11.取上述10-15μL樣品,加入2-3μL上樣緩沖液和1.5%瓊脂糖凝膠電泳(凝膠和電泳緩沖液TBE中均加入0.5μg/mL溴化乙錠);
65438±02.5V/cm電泳65438±0小時,紫外燈下觀察拍照。