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瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA電泳得到的條帶有哪些?

溴化乙錠是壹種高度敏感的熒光染色劑,用於觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA。溴化乙錠被標準的302nm紫外光透射儀激發,發出橙紅色信號,可被寶麗來底片或凝膠成像處理系統用CCD成像頭拍攝。

在瓊脂糖凝膠中觀察DNA最常見的方法是用熒光染料溴化乙錠染色,溴化乙錠含有壹個三環平面基團,可以嵌入DNA堆積堿基之間。它與DNA的結合幾乎沒有堿基序列特異性。在高離子強度的飽和溶液中,大約每2.5個堿基插入壹個溴化乙錠分子。當染料分子插入時,其平面群垂直於螺旋軸,通過範德華力與上下堿基相互作用。該基團的固定位置及其與堿基的緊密接近導致了與DNA結合的染料的熒光,其熒光產率高於遊離溶液中的染料。DNA吸收254納米的紫外輻射並將其傳遞給染料,而結合的染料本身吸收302納米和366納米的光輻射。在這兩種情況下,吸收的能量在可見光譜的紅橙色區域中的590nm處被重新發射。因為溴化乙錠-DNA復合物的熒光產率比沒有DNA結合的染料高20-30倍,所以當凝膠含有遊離溴化乙錠(0.5ug/ml)時,可以檢測到少至10ng的DNA條帶。

溴化乙錠可用於檢測單鏈或雙鏈核酸(DNA或RNA)。而染料對單鏈核酸的親和力相對較小,所以它們的熒光產額相對較低。事實上,單鏈DNA或RNA的大部分熒光是由染料結合到分子上形成短的分子內螺旋而產生的。

雖然線型DNA的電泳遷移率在這種染料的存在下降低了約15%,但當需要知道DNA片段的確切大小時(如DNA限制性酶切圖譜的鑒定),凝膠應不加EB電泳,電泳後用EB染色。染色後壹般不需要脫色。但檢測少量DNA片段(小於10ng)時,通常需要對染色後的凝膠進行脫色處理。