1.將-80℃凍存的菌株接種到固體BHI培養基中，37℃培養65438±08h活化。選擇單菌落，在5mL液體BHI培養基中於37℃和200轉/分鐘培養過夜。第二天按1:100的比例轉接到1L新鮮液體BHI培養基中，繼續培養至OD600為1.0。
2.2.2超濾濃縮提取膜囊泡當細菌培養至OD600為1.0時，4℃6000 r/min離心20min收集上清液，用0.45μm或0.22μm濾膜過濾，然後轉入分子量為100kD的超濾濃縮管，4℃4000 r/min離心20min。取濃縮液，4℃，365，438+065，438+074 r/min離心3小時，棄去上清液，用65，438+00 ml磷酸鹽緩沖液懸浮沈澱，重復離心壹次，將沈澱重懸於65，438+0 ml磷酸鹽緩沖液中，用0.22μm濾膜過濾，無菌檢查，保存於-80℃。提取的EGDe、EGDE δ PRFA和EGDE δ PRFA+Perl3-PRFA *的膜囊泡分別表示為EGDe-MVs、δδprfA-MVs和prfA*-MVs。
3.通過Optiprep密度梯度離心提取膜囊泡用濃度分別為25%、30%、35%、40%和45%的DMEM制備Optiprep梯度離心溶液。吸取超濾濃縮法提取的1mL產物(同1.2.2)，轉移至貝克曼離心管，然後依次加入45%、40%、35%、30%、25% opti prep 2mL，4℃，31174r/。離心後仔細收集貝克曼離心管中30%-35%的組分，加入10mL磷酸鹽緩沖液，再次超速離心。重復離心三次後，棄去上清液，沈澱物重懸於1mL磷酸鹽緩沖液中，經0.22μm濾膜過濾，無菌檢驗，保存於-80℃，即為提取的膜囊泡。
4.用BCA法測定膜囊泡的蛋白質濃度，計算膜囊泡的產量。MVs蛋白濃度的具體測定方法，請參考BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書。用稀釋平板塗布法計數OD600為1.0時的菌落數，用每1013 CFU獲得的蛋白質量確定膜泡的產量。
5.負染電鏡觀察膜泡形態。將銅網浸泡在MVs樣品中約20分鐘，然後取出。用濾紙垂直接觸銅網，去除多余的液體。然後將銅網浸泡在PTA染料溶液中5分鐘，取出後自然陰幹2-3天，即可用於電鏡觀察。
6.對細菌生物被膜形成的影響培養和細菌生物被膜的檢測參見鳳飛飛等【10】。將3個菌株的MVs稀釋至相同濃度(0.2mg/mL)後，將100μL對應的MVs按1:1的比例加入到含有100μL菌液(同菌株或不同菌株)的96孔板中。此外，還設置了兩組無MVs的參照:壹組加入等量的菌液，另壹組加入等量的磷酸鹽緩沖液。上述操作後，96孔板在37℃下分別培養24、48和72小時。相應培養時間後，用酶標儀測定OD600值，檢測其生長情況。隨後，丟棄每個孔的培養基，用蒸餾水洗滌生成的生物膜，室溫幹燥，用1%草酸銨結晶紫染色，並測定其光吸收值OD595。實驗數據用Origin8和SPSS22進行分析。用結晶紫染色的生物膜在倒置顯微鏡下直接觀察，並拍照和記錄。
7.膜囊泡溶血活性的檢測溶血活性的測定參考了Xinhui等[12]的方法。將來自不同菌株的MVs稀釋至相同濃度(0.2mg/mL)後，將壹定量的MVs加入到含有1mL紅細胞懸液的離心管中，陰性對照組加入相同量的磷酸鹽緩沖液，陽性對照組加入相同量的無菌水。另外，在1毫升紅細胞懸液中加入等量的MVs，再加入2毫摩爾/LDTT。離心管37℃孵育3小時，然後室溫2600r/5min離心5分鐘，吸取800μL上清液，測定壹次性比色皿中OD543的值，即為MVs的溶血活性值。
8.膜泡對棉鈴蟲幼蟲體重、存活率、化蛹率和發育時間的影響[13]。將不同品系的MVs稀釋至相同濃度(0.2mg/mL)後，在仔魚第壹腹足下吸收並註射5 μm-MVs，對照組註射等量的磷酸鹽緩沖液，每組18只仔魚。註射後，每24小時稱壹次幼蟲的重量，統計存活率、化蛹率和幼蟲發育時間(從購買之日到最後壹齡)。數據的計算方法為:化蛹率=蛹數/試驗昆蟲總數×100%；存活率=存活數/試蟲總數×100%。