目錄
壹.細胞
第二，常規培養——保持胚胎幹細胞處於未分化狀態
培養基
細胞恢復
冷凍細胞
明膠塗層
細胞傳代
第三，體外分化
培養基
塗有聚鳥氨酸/纖連蛋白的培養板(有或沒有蓋玻片)
體外分化方法
第四，移植細胞的制備
細胞
多能胚胎幹細胞在小鼠胚泡中產生。
1.表達綠色熒光蛋白的B5-ES細胞(EGFP)。納吉博士的實驗室準備的。
2.D3-ATCC；CRL-1934。我們拿到的時候，已經傳了大概17代了。
3.j 1-由Jaenish博士實驗室友情提供。我們拿到手的時候，大概傳了7-9代。
4.J1 RTTA-RTTA表達J1細胞，由Jaenish博士的實驗室友誼提供。
5.表達黃色熒光蛋白的YC5-ES細胞由Nagy博士的實驗室提供。
常規培養-將ES細胞維持在未分化狀態
ES細胞培養使用含有ESGRO(白血病抑制因子)的高糖培養基來阻止細胞分化。為細胞提供塗有0.1%明膠的平板，作為細胞粘附的基質。建議細胞每2-3天從80%-90%融合的平板上傳代壹次，比例為1: 8。細胞傳代後，在將細胞接種到0.1%明膠包被的培養皿中之前，應通過將細胞接種到未包被的組織培養板中2小時來分離分化細胞和未分化細胞。細胞在37℃、5% CO2和65438±000%濕度下培養。
培養基
ES:
制備不含DMEM、HS和ESGRO的20倍溶液(該溶液也可用於EB培養基-見下文)。包裝在50毫升FALCON試管中(稀釋2倍，每管42毫升),儲存於-20℃。通過將21毫升該溶液、HS和ESGRO加入450毫升DMEM中制備培養基，並用0.2μm濾膜過濾。儲存在4℃下。註:壹瓶DMEM是500ml。
儲存液體
DMEM(高糖)
馬血清
L-谷氨酰胺(200毫米)
MEM NEAA(10毫米)
赫普斯(1米)
β-巰基乙醇(55毫米)
害蟲
埃斯格羅
復蘇細胞
將細胞冷凍在10%二甲基亞碸(DMSO)中，以防止會損傷細胞的晶體形成。但二甲基亞碸對細胞有毒性，所以快速進行細胞復蘇非常重要。
步驟:
1.從液氮中取出壹管細胞；
2.將冷凍管放入37℃的水浴中2分鐘(或者管內溶液剛好完全溶解)；
3.將細胞轉移到15毫升Falcon試管中；
4.加入5ml ES培養基(用培養基沖洗凍存管)；
5.離心3分鐘；
6.棄去上清液，用2ml ES培養重懸細胞，至少吹10次；
7.接種在塗有明膠的6孔或6cm組織培養皿中(見下文)；
8.孵化。
冷凍細胞
冷凍儲存溶液
90% HS和10% DMSO
步驟:
1.1× PBS洗細胞，培養皿中留少許PBS；
2.用細胞刮刀收集細胞；
3.將細胞轉移到15ml Falcon試管中，離心3分鐘；
4.棄去上清液，將細胞重新懸浮在冷的冷凍溶液中(10cm培養皿為2ml，15cm培養皿為6-7ml。)
5.分裝於冷凍管中，每管為1ml；
6.在-80℃放置過夜，第二天移入液氮中。
明膠塗層
準備500ml 0.1%明膠溶液。
1.將0.5g明膠溶於500ml不含鈣和鎂的PBS中(50-65℃水浴15 ~ 30分鐘)。
2.溶液最好不經冷卻，用0.2μm濾膜過濾，保存在4℃下。
塗層培養皿或皮氏培養皿
1.加入足夠的明膠溶液覆蓋培養平面(15cm培養皿2ml，10cm培養皿0.5 ~ 1ml)。溶液的量不重要，只要能完全覆蓋培養面即可。);
2.室溫放置30分鐘；
3.取出明膠溶液，在室溫下將培養板保存在包裝袋中。最好將平板做成方形，防止明膠汙染蓋子，流出培養板。
細胞傳代
建議細胞每2-3天傳代壹次。過度生長的細胞會降低細胞的自然分化率。我們建立了壹種去除分化細胞的純化方法。在將細胞接種到明膠包被的培養板上之前，通過將分化的細胞粘附到未包被的組織培養板上來除去它們。純化步驟包括在以下方法中。
1.取出培養液；
2.1×無鈣鎂PBS洗滌；
3.加入1×胰蛋白酶EDTA(用PBS稀釋的10×胰蛋白酶EDTA。)在37℃孵育5分鐘。
4.加入ES培養基使胰酶失活；
5.將細胞轉移到15ml離心管中，離心3分鐘；；
6.去除上清液，將細胞重新懸浮在2毫升培養基中，並吹至少10-20次。
如果加入的培養基量少，將更容易分離細胞團。ES細胞容易聚集，因此在傳代過程中小心分離非常重要。這可能會降低細胞的自然分化。
7.將細胞接種在未塗布的組織培養皿中(使用與開始時相同的規格)，並將其置於培養箱中2小時(在此期間分化的細胞將粘附，而ES細胞將保持懸浮)；
8.將含有細胞的培養基轉移到塗有明膠的組織培養皿中(見下文)。吹氣以確保細胞分散(如前所述，胚胎幹細胞傾向於聚集成團)
9.建議采用1: 4-1: 10的比例通行(ATCC)。
保持細胞的通過率是非常重要的。在我們的經驗中，1: 8的比例是好的，可以盡量減少細胞的自然分化。當使用不同規格的培養板進行細胞傳代時，可使用表1計算傳代比例。
體外分化
多能胚胎幹細胞可以在體外和體內分化成各種類型的細胞。我們的體外分化方法有利於在最少量的培養基中選擇神經前體細胞(步驟3)，在bFGF存在下擴增(步驟4)和在步驟5中最終分化。細胞在37℃、5% CO2和65438±000%濕度下培養。
時間表(總時間為27 ~ 34天)
第二步；4+1天第三步；4-10天第四步；4天內第5步；10-15天
培養基
EB
制備不含DMEM、FBS和ESGRO的20倍溶液(該溶液也可用於ES培養基-見上文)。包裝在50毫升FALCON試管中(稀釋2倍，每管42毫升),儲存於-20℃。將21毫升該溶液和50毫升胎牛血清加入450毫升DMEM中制成培養基，用0.2μm濾膜過濾。儲存在4℃下。註:壹瓶DMEM是500ml。
儲存液體
DMEM(高糖)
胎牛血清
L-谷氨酰胺(200毫米)
MEM NEAA(10毫米)
赫普斯(1米)
β-巰基乙醇(55毫米)
有害生物(p 104 u/毫升104微克/毫升
ITSFn和N3:
制備不含DMEM/F12的20倍溶液。分裝於15ml FALCON管中(稀釋至1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml)，用0.2μm濾膜過濾，保存於-20℃。將該溶液添加到DMEM/F12中以制備培養基，並保存在4℃下。
儲存液體
DMEM(高糖)
轉鐵蛋白50毫克/毫升
胰島素5毫克/毫升
亞硒酸鈉300μM
孕酮(20μM)
腐胺(100μM)
有害生物(P104U/ml S104μg/ml)
層粘連蛋白100微克/毫升
纖連蛋白250微克/毫升
堿性rhFGF，10微克/毫升。
*在步驟4中，向N3培養基中加入bFGF，使最終濃度為10ng/ml。
ITSFn和N3培養基保存液的制備
使用無菌溶劑和稀釋劑，並在分裝前過濾溶液。如果溶液因為某種原因在分裝前沒有經過過濾，就需要在試管上標註出來，讓別人在使用時知道該溶液不能直接用於細胞培養。
儲存溶液溶劑、儲存溶液、稀釋劑和儲存
轉鐵蛋白50毫克/毫升
胰島素5毫克/毫升
亞硒酸鈉300μM
孕酮(20μM)
腐胺(100μM)
有害生物(P104U/ml S104μg/ml)
層粘連蛋白(100微克/毫升)
纖連蛋白(250微克/毫升)
堿性重組人生長因子(10微克/毫升)
塗有聚鳥氨酸/纖連蛋白的培養板(有或沒有蓋玻片)
塗層溶液的制備
聚L-鳥氨酸，15微克/毫升
將75毫升聚L-鳥氨酸與425毫升1×PBS混合。儲存在4℃下。
纖連蛋白，1微克/毫升
將0.5毫升纖連蛋白與500毫升500毫升1×PBS混合。
塗層工藝:
1.加入聚-L-鳥氨酸至少2-3小時(過夜也是可以接受的)。
2.多聚L-鳥氨酸的抽吸
3.加入纖連蛋白約1-2小時。
4.吸出纖連蛋白，晾幹30分鐘。
5.儲存在4℃下
24孔板為200μl，6孔板為500μl。搖動培養板，確保溶液能夠覆蓋蓋玻片或培養孔。有時需要劇烈搖動培養板。
體外分化方法
步驟1: ES介質
在LIF存在下維持細胞培養(ESGRO)
第二步:EB培養基
使用細菌培養皿去除LIF後，需要4天才能形成胚狀體。
1.分散和純化細胞(參見上面的細胞傳代部分)
2.純化2小時後，將細胞轉移到含有ES培養基的50毫升Falcon管中，計數細胞，將適當體積放入15毫升管中，離心3分鐘。
3.用2mlEB培養重懸浮細胞，至少吹10次，制成單細胞懸液。
4.壹個15cm的細菌培養皿可以接種4 ~ 5× 106個細胞(1個完全融合的組織培養皿通常足以接種4個相同規格的細菌培養皿)。
5.2天後，更換培養基。
將胚狀體轉移到錐形管中，放置3-5分鐘，使細胞沈澱。丟棄上清液，將細胞重新懸浮在新鮮培養基中，並將其接種到新的細菌培養皿中。
6.在EB培養的第4天，將細胞轉移到未塗布的組織培養皿中(這是細胞移植步驟)。在1個組織培養皿中，放置1個細菌培養皿，在第三步前壹天將胚狀體附著在相同規格的培養皿上。
形成胚狀體需要4天。在EB培養基中培養1天後，胚狀體附著在組織培養皿表面。這壹天被認為是第二步和第三步的分界線。
步驟3 - ITSFn培養基
在基本培養基中選擇神經前體細胞。
1.胚狀體在組織培養皿中接種壹天後，培養基換成ITSFn培養基。
2.在此期間，並非所有的胚狀體都已粘附，因此在移除培養基時應小心，以保持培養皿中的大多數胚狀體。
3.保持細胞在ITSFn中培養約10天，並根據需要更換培養基-大約每隔壹天。
觀察細胞形態，第4 ~ 7天出現神經樣細胞。當可以識別神經元樣細胞時，進行步驟4。步驟的轉換應該是在神經前體細胞出現第壹個明確跡象後的幾天，壹般是從第6天到第3步的第10天。
第四步-N3培養基++堿性成纖維細胞生長因子
神經前體細胞在含有10ng/ml bFGF的培養基中培養用於擴增。
用1洗。PBS，並加入2ml 1×胰蛋白酶(15cm的1培養皿所需的胰蛋白酶量以上表體積為準)(10×胰蛋白酶EDTA用PBS稀釋)。
在2.37℃下孵育5分鐘。
3.用4mlEB培養基停止胰酶活性，將細胞轉入錐形管中3 ~ 5分鐘除去細胞團，將上清液轉入新的離心管中離心。
4.將細胞懸浮在含有bFGF的N3培養基中。
5.將細胞接種在塗有聚-L-鳥氨酸/纖連蛋白的蓋玻片上(最好將蓋玻片放在24孔培養板或6孔培養板上，6孔培養板的每個孔放5塊蓋玻片。如果是塑料的，放4個蓋玻片，最大化樣本數量)。在24孔板中接種3.5×105/孔或在6孔板中接種1.7×106/孔。
6.2天後，更換培養基。
第五步-N3培養基
去除bFGF誘導神經前體細胞分化
1.將細胞接種在蓋玻片上4天後，將培養基換成不含bFGF的N3培養基。
2.根據需要更換液體(大約每隔壹天)
3.分化10 ~ 15天後固定化細胞。
去除培養基
PBS洗滌
加入4%福爾馬林
在室溫下放置30分鐘。
PBS洗滌兩次
儲存在PBS中。使用含0.01%疊氮化鈉的PBS進行長期儲存。
移植細胞的制備
在胚狀體形成後4天移植細胞(對應於體外分化過程的第二步，將細胞轉移到組織培養板上)。如前面體外分化所述，在移植前4天胚狀體開始形成。將胚狀體移植到10cm的培養皿中通常還需要壹天。
移植
1.將胚狀體轉移到15ml錐形管中，靜置3 ~ 5分鐘。
最好將細胞離心3分鐘。讓其沈降將去除更多的單細胞(包括死亡細胞),並且這些細胞可以被離心。
2.去除上清液並將胚狀體重量懸浮在不含鈣和鎂離子的1×PBS中。
3.離心3分鐘
4.去除上清液，加入1×胰蛋白酶(10cm培養皿，1ml)。
5.37℃水浴5分鐘。
6.加入5mlEB培養基，小心吹約10次。
小心處理細胞非常重要，鋪展時不要用力吹。
7.離心2分鐘
8.吸出上清液，將細胞重新懸浮在500μl EB培養基中。
9.用光滑的巴斯德吸管仔細吹5次。
10.離心兩次。
11.吸出上清液，將細胞重懸於100μl EB培養基中。
煙酸己酮可可堿標記的胚胎幹細胞移植
1.配制10μg/ml煙酸堿性染料溶液(二苯酰亞胺，在冰櫃118)。
2.將1mg(妳能稱出的最小量)加入5ml EB培養基中(制成200μg/ml)。
3.將溶液稀釋至10μg/ml(100μl 200μg/ml溶液和1.9ml EB培養基)。
4.如上所述，將細胞重懸於2ml煙酸堿染色溶液而不是EB培養基中，以制備ES細胞懸浮液。
5.將懸浮液在室溫(或冰上)放置30分鐘。
6.離心2分鐘
7.吸出上清液，將細胞重新懸浮在2ml EB培養基中。
8.重復壹遍
9.離心2分鐘
10.吸出上清液，將細胞重懸於100μl EB培養基中，置於冰上。這是我最近翻譯的壹篇關於胚胎幹細胞的文章。翻譯的不好，但是意思要準確。對不起，有兩個表格沒有寄出。哪位老師能告訴我怎麽編輯它們？非常感謝！謝謝妳丁！我也有壹個好帖子！我找了很久，終於找到了。非常感謝！謝謝，還沒用，先了解壹下吧。再次感謝！謝謝妳。謝謝您們。妳有原件嗎？
如果有，可以發到我郵箱(j3104@163.com)嗎？謝謝大家！好糊！
可以粘貼英文原文嗎？或者發到我的郵箱:adjfchen@hotmail.com。
謝謝，不錯，不錯。我在這裏發壹些關於幹細胞的知識。
幹細胞的概念
幹細胞是壹類具有自我更新和分化潛能的細胞。它包括胚胎幹細胞和成體幹細胞。幹細胞的發育受到許多內部機制和微環境因素的影響。目前，人類胚胎幹細胞已經在體外培養成功。最近的研究發現，成體幹細胞可以橫向分化為其他類型的細胞和組織，這為幹細胞的廣泛應用提供了基礎。
在胚胎發育過程中，單個受精卵可以分裂發育成多細胞組織或器官。在成年動物中，正常的生理代謝或病理損傷也會引起組織或器官的修復和再生。胚胎分化和成體組織再生是幹細胞進壹步分化的結果。胚胎幹細胞是全能的，具有分化成幾乎所有組織和器官的能力。成體組織或器官中的幹細胞壹般被認為是組織特異性的，只能分化成特定的細胞或組織。
然而，目前這種觀點受到了挑戰。
最新研究表明，組織特異性幹細胞還具有分化為其他細胞或組織的潛能，這為幹細胞的應用開辟了更廣闊的空間。
幹細胞具有自我更新能力，能夠產生高度分化的功能細胞。幹細胞根據存活階段分為胚胎幹細胞和成體幹細胞。
1.1胚胎幹細胞
胚胎幹細胞
當受精卵分裂成胚泡時，內細胞團中的細胞就是胚胎幹細胞。胚胎幹細胞是全能的、自我更新的，並且能夠分化成身體中的所有組織。早在1970，馬丁·埃文斯就已經從小鼠體內分離出胚胎幹細胞，並進行體外培養。直到最近，人類胚胎幹細胞的體外培養才獲得成功。
此外，胚胎幹細胞(ES細胞)是高度未分化細胞。它具有發育全能性，可以分化成成年動物的所有組織和器官，包括生殖細胞。胚胎幹細胞的研究和利用是生物工程領域的核心問題之壹。對ES細胞的研究可以追溯到20世紀50年代，對ES細胞的生物學研究始於畸胎瘤幹細胞(EC細胞)的發現。
目前，許多研究工作都是在小鼠ES細胞上進行的。例如，德國和美國的醫療團隊去年成功地將ES細胞培養的膠質細胞移植到實驗鼠體內。此後，密蘇裏的研究人員通過小鼠胚胎細胞移植技術恢復了癱瘓貓的部分肢體。隨著對ES細胞研究的深入，生命科學家對人類ES細胞的認識進入了壹個新的階段。1998年底，兩個研究小組成功培養了人胚胎幹細胞，保持了胚胎幹細胞分化為各種體細胞的全能性。這使得科學家利用人類胚胎幹細胞治療各種疾病成為可能。然而，對人類胚胎幹細胞的研究在世界範圍內引起了巨大的爭議。出於社會倫理的考慮，壹些國家甚至明令禁止對人類胚胎幹細胞的研究。無論從基礎研究還是臨床應用的角度來看，人類ES細胞帶來的好處都遠大於可能對倫理道德帶來的負面影響，因此對人類ES細胞研究的呼聲也是如潮。
1.2成人幹細胞
成年動物的許多組織器官，如表皮、造血系統等，都具有修復和再生的能力。成體幹細胞在其中發揮了關鍵作用。成體幹細胞在壹定的條件下，要麽產生新的幹細胞，要麽按照壹定的程序分化成新的功能細胞，從而保持組織器官生長和衰退的動態平衡。以前認為成體幹細胞主要包括上皮幹細胞和造血幹細胞。最近的研究表明，被認為不可再生的神經組織仍然含有神經幹細胞，這表明成體幹細胞無處不在。問題是如何找到和分離各種組織特異性幹細胞。成體幹細胞通常位於特定的微環境中。微環境中的間充質細胞可以產生壹系列生長因子或配體，與幹細胞相互作用，控制幹細胞的更新和分化。
1.3造血幹細胞沒問題
造血幹細胞是體內各種血細胞的唯壹來源，主要存在於骨髓、外周血和臍帶血中。今年年初，北京協和醫科大學血液研究所的龐文新在肌肉組織中發現了具有造血潛能的幹細胞。造血幹細胞移植是治療血液病、先天性遺傳性疾病和多發性、轉移性惡性腫瘤疾病的最有效方法。