HRP的分子量小(40kDa)，標記物容易滲入細胞。底物為H2O2，以二氨基聯苯胺(DAB)為氫供體的反應產物為不溶性棕色吩嗪衍生物，普通光學顯微鏡即可觀察到。在pH 3.5 ~ 12範圍內穩定，對熱和有機溶劑有穩定作用，可耐受63℃加熱15 min。用甲苯和石蠟包埋或用純乙醇和10%甲醛溶液固定為冰塊，均不影響活性。溶解性好，5gHRP可溶於100mL緩沖鹽溶液，可溶於飽和度62%以下的硫酸銨溶液，因此常采用硫酸銨分級沈澱法進行分離純化。氰化物、硫化物、氟化物和疊氮化物能抑制HRP的活性，因此應避免使用NaN3作為酶標試劑的防腐劑，以防失活。
任何能在HRP和H2O2存在下被酶催化與H2O2反應生成有色產物的化合物(氫供體)都可以使用顯色劑。氫供體的產物可分為不溶性和可溶性兩種。前者為3，3 '二氨基聯苯胺(DAB)，適用於免疫組織化學。反應後，氧化的中間體迅速聚合形成不溶的棕色吩嗪衍生物。這種聚合物還能還原和螯合四氧化物，形成具有電子密度的產物，適用於電子顯微鏡檢查。此外還有飽和聯苯胺溶液，氧化產物為黃褐色，多用於酶免疫擴散的深線顯色。鄰苯二胺(OPD)是後者最常用的。該產品呈橙色，易溶且敏感，其最大吸收值為490nm，肉眼即可識別。易被濃酸終止，顏色可保持數小時不變，是ELISA中最常用的壹種。但對光敏感，使用時應避光，有致癌作用。
為了用辣根過氧化物酶標記抗體，需要借助交聯劑將酶連接到抗體分子上。常用的交聯劑有高碘酸鈉和戊二醛(CHO-(CH2)3-CHO-(CH2) 3-CHO)。HRP分子中與酶活性無關的糖基被高碘酸鈉氧化成醛基，然後與抗體蛋白的氨基形成席夫堿。為了防止酶蛋白的氨基和醛基自偶聯，在標記前用2，4-二硝基氟苯(DNFB)封閉酶蛋白中剩余的α-和ε-氨基。酶和抗體結合反應後，加入硼氫化鈉(NaHB4)還原成穩定的綴合物。
[標記步驟]
(1)將5 mg辣根過氧化物酶溶於0.5mL蒸餾水中，加入1% 2，4和0.1mL二硝基氟苯(DNFB)無水乙醇溶液，在室溫(20℃)下輕微攪拌1h。
(2)加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室溫下避光輕輕攪拌30min，溶液變為黃綠色。
(3)加入65438±0毫升0.65438±0.6摩爾/升的乙二醇，在室溫(20℃)下輕輕攪拌65438±0小時，以終止氧化反應。
(4)加入5mg抗體(Ig)，置於透析袋中，放入pH9.6的1 000 ml碳酸鹽緩沖液(無水碳酸鈉1.5g，碳酸氫鈉2.93g，蒸餾水加至1 000 ml)中，4℃透析過夜3次。
(5)從透析袋中取出液體(約3 mL ),在4℃下加入5 mg/ml nahb40.2 ml，放置2小時或過夜。
(6)加入50%飽和硫酸銨(NH4)2SO4溶液(硫酸銨850g，蒸餾水至1 000 mL，用30%氨水調節pH至7.2)6mL沈澱結合物，然後在4℃放置30 min，以3 000r/min離心30min，取深層溶液(SPA不需要此步驟)。
(7)將沈澱溶於PBS(0.02M pH7.4)中，放入透析袋中，用此緩沖液透析6-12h，換液3次。
(8)向偶聯物中加入BSA至蛋白濃度為10mg/ mL，或加入等量的60%甘油，測定工作效價，然後少量分裝(或凍幹，不加甘油)低溫保存備用。戊二醛是壹種常用的同雙功能交聯劑，其兩個醛基分別與HRP和抗體蛋白的氨基結合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白偶聯物。反應可在溫度範圍為4-40℃、pH為6.0-8.0的緩沖溶液中進行，分為壹步法和兩步法。戊二醛壹步法是將酶和待標記的抗體混合，同時加入戊二醛進行交聯反應。戊二醛兩步法是酶與戊二醛反應形成酶-戊二醛結合物，通過透析或層析除去，然後與抗體結合。
[標記步驟]
(1)將10mgHRP溶於0.2毫升1.25%戊二醛(用0.01mol/L和pH6.8PB稀釋25%戊二醛至1.25%)，室溫(約20℃)反應合並65433。
(2)用0.1.5 mol/l NaCl的Sephadex G-50凝膠柱洗脫，去除遊離戊二醛，或用0.01mol/L PBS透析，4℃過夜。
(3)將5mg抗體IgG溶於1mL 0.1.5mol/L NaCl中，然後與醛類HRP溶液(10mg/mL)混合。
(4)加入pH 9.6的0.1ml1mol/L碳酸鹽緩沖液(調節pH至9.0 ~ 9.6)，在4℃電磁攪拌下合並24h。
(5)加入0.1mL0.2mol/L賴氨酸(0.29g溶於10mL蒸餾水中)並在4℃放置2h以封閉殘留的醛基並終止反應。
(6)放入透析袋中，用0.01mol/L PBS和pH7.2 PBS在4℃透析過夜或過Sephadex G-200凝膠柱層析，用PBS洗脫，收集1峰的洗脫液，加入等量的60%甘油，測定工作效價，然後在4℃或-20℃少量分裝。