1，DNA的分子大小和構型
不同構型DNA的移動速度順序為:共價閉合環狀DNA (CCCNA)>線性DNA & gt開環雙鏈環狀DNA。線性雙鏈DNA分子在壹定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移率與DNA分子量的對數成反比。分子越大，阻力越大，越難在凝膠孔中爬行。
因此，當瓊脂糖濃度過高時，環狀DNA(壹般為球形)無法進入凝膠，相對遷移率為0(Rm=0)，而同樣大小的線性雙鏈DNA(剛性棒)可以在長軸方向向前移動(RM >: 0)，可見這三種構型的相對遷移率主要取決於凝膠濃度。
2.瓊脂糖濃度
給定大小的線性DNA分子在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移速度是不同的。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度線性相關。凝膠濃度的選擇取決於DNA分子的大小。分離小於0.5kb的DNA片段所需凝膠濃度為1.2-1.5%，分離大於10kb的DNA分子所需凝膠濃度為0.3-0.5%。
3.DNA分子的構象
當DNA分子處於不同的構象時，它在電場中運動的距離不僅與分子量有關，還與其自身的構象有關。相同分子量的線性、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中運動速度不同，超螺旋DNA運動最快。
線性雙鏈DNA移動最慢。如果難以確定凝膠上的幾條DNA帶是質粒DNA的不同構象引起的還是其他DNA引起的，可以從瓊脂糖凝膠上壹條壹條回收DNA帶，用同壹種限制性內切酶水解，然後電泳。如果凝膠上出現相同的DNA圖譜，就是相同的DNA。
4.供電電壓
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA的實驗條件表明，低濃度、低電壓下分離效果較好，低電壓下線性DNA分子的電泳遷移率與外加電壓成正比。
但隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率會有不同程度的增加。片段越大，電場強度增加引起的遷移率增加越大，所以瓊脂糖凝膠的有效分離範圍會隨著電壓的增加而減小。為了實現大於2kb的DNA片段的最大分辨率，電場強度不應高於5V/cm。
5.嵌入染料的存在
熒光染料溴化乙錠用於檢測瓊脂糖凝膠中的DNA。染料將被嵌入堆疊的堿基對之間，並拉伸長的和有缺口的環狀DNA，使其更加剛性，並將線性DNA遷移率降低15%。
6.離子強度的影響
電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。沒有離子的時候(比如錯用蒸餾水配制凝膠)，電導率最小，DNA幾乎不動。在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，電導率很高，明顯發熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。對於天然雙鏈DNA，常用幾種電泳緩沖液，如TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸]、TBE(Tris-硼酸和EDTA)、TPE(Tris-磷酸和EDTA)，壹般配制成濃縮母液，室溫保存。