1.先取出內消毒桶，在外鍋內加入適量水，使水位與三腳架持平。放回消毒桶，然後把要消毒的物品放進去。註意不要安裝得太擁擠，以免阻礙蒸汽流動，影響殺菌效果。三角瓶和試管口不要與桶壁接觸，以免紙被冷凝水浸入棉塞中。
2.蓋上蓋子，將蓋子上的排氣軟管插入內部滅菌桶的排氣槽中。然後對稱地同時擰緊兩個相對的螺栓，使螺栓松緊壹致，避免漏氣。
3.用電爐或煤氣加熱，同時打開排氣閥，使水沸騰，排出鍋內冷空氣。冷空氣完全排出後，關閉排氣閥，讓鍋內溫度隨著蒸汽壓力的增加而逐漸升高。當鍋內壓力升至所需壓力時，控制熱源和維持壓力所需的時間。本實驗中，1.05 kg/cm~2，2121.3℃殺菌20min。
4、滅菌時間到期後，切斷電源或關閉煤氣，讓滅菌器內的溫度自然下降。當壓力表壓力降至0時，打開排氣閥，松開螺栓，打開蓋子，取出已滅菌物品。如果壓力沒有降到0，打開排氣閥，鍋內壓力會突然下降，容器內的培養基會因為內外壓力不平衡而沖出燒瓶或試管口，造成培養基的棉塞汙染。
5.將滅菌後的培養基放入37℃培養箱中24小時。檢查後如無雜菌生長，可備用。