酵母單雜交是根據DNA結合蛋白(轉錄因子)結合DNA順式作用元件調節報告基因表達的原理,克隆與靶元件特異性結合的轉錄因子基因(cDNA)的有效方法。其理論基礎是,許多真核轉錄激活子是由DNA結合結構域BD和激活結構域AD組成的,它們在物理和功能上是獨立的。因此,可以構建各種基因和AD的融合表達載體。當在酵母中作為融合蛋白表達時,可以根據報道基因的表達來篩選與靶元件具有特異性結合區域的蛋白質。理論上,在單雜交檢測中,任何靶元件都可以用於篩選具有特定結合區域的蛋白質。