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用於標記的酶聯免疫吸附試驗

用於標記抗體或抗抗體的酶必須具有以下特性:高活性和靈敏度;室溫下穩定;反應產物容易出現;可以商業化。目前應用廣泛的有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶,其中以辣根過氧化物酶應用最為廣泛。過氧化物酶在植物中分布廣泛,其中以辣根的含量最高。從辣根中提取的辣根過氧化物酶(HRP)是壹種糖蛋白(糖含量為18%),由無色的酶蛋白和深褐色的鐵卟啉組成。其分子量約為40 000,由約300個氨基酸組成。它的等電點是3-9。催化反應的最佳pH值因供氫體而異。該酶溶於水和飽和度低於50%的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔助基團的最大吸收光譜分別為275nm和403nm。

酶的純度表示為RZ: RZ=OD403/OD275。

純酶的RZ大多在3.0以上,最高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶,非酶蛋白約占75%,不能用於標記。2.5以上的RZ可以用來做標記。HRP的底物是過氧化氫,催化反應時有幾種供氫體:(1)鄰苯二胺(OPD),產物為橙色,易溶,靈敏度高,最大吸收值為490nm,肉眼即可判斷,易被濃H2SO4終止,數小時不變色,是國內ELISA中最常用的壹種;(2)山莨菪堿(OD),本品為橙色,最大吸收值為400nm,顏色穩定;(3)5-氨基水楊酸(5-As):本品為深棕色,最大吸收值為449nm,部分溶解,靈敏度差;(4)鄰甲苯胺的產物為藍色,最大吸收值為630nm。部分可溶,不穩定,耐酸,但反應快,顏色明顯。從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取,由幾種同工酶組成。底物種類很多,常用的是硝基苯磷酸鹽,廉價無毒。酶解產物為黃色可溶性,最大吸收值為400nm。該酶的活性基於1μg苯基磷酸二鈉在pH10的反應體系中於37℃水解0 min。