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配液操作流程

配液操作流程如下:

介紹了PCR的詳細操作流程,強調了實驗中的註意事項,並列出了常用緩沖液的配方。幫助我們在理解實驗的基礎上更順利的操作。

聚合酶鏈式反應(PCR)是壹種體外合成雙鏈DNA的方法。其原理類似於天然DNA的復制過程,其特異性主要依賴於與其目的片段兩端互補的特異性引物和高度特異性的酶(熱啟動酶)。壹個典型的PCR反應有三個步驟:變性、退火和延伸,經過反復的循環反應得到目的片段。

壹、試劑制備

1.DNA模板

2.特異性引物

3.dNTP混合

4.PCR緩沖液

5.熱啟動酶

二。操作步驟

1.構型反應系統

將各組分依次加入0.5毫升離心管中。

擴增使用熱啟動酶,可以在室溫下操作,非熱啟動酶要在低溫下配置反應體系。

2.按照試劑盒說明設定反應時間和溫度,擴增後進行電泳鑒定。

3.瓊脂糖核酸電泳

用蒸餾水清洗電泳用的器具,並設置梳子。

根據待分離DNA片段的大小,制備適當濃度的瓊脂糖凝膠,準確稱取壹定量的瓊脂糖加入錐形瓶中,加入約30ml電泳緩沖液(TAE或TBE)。

在微波爐中加熱熔化,冷卻至40℃左右,充分混合,倒入電泳槽中。

室溫固化40分鐘左右,小心拔出梳子,將凝膠放入電泳槽中準備樣品。

在電泳槽中加入電泳緩沖液,使其能溢出凝膠表面,取樣孔中不應有氣泡。

取樣前準備好樣品,加入5ul樣品,將1ul的6倍稀釋緩沖液和1ul的染料混合,用抓子將混合好的樣品慢慢註入取樣孔,註意不要穿過孔。

根據正負極(紅色正極,黑色負極),接通電源,電壓40-60V,時間30-40min,根據溴酚藍的位置可以判斷是否終止電泳。

電泳結束後,關閉電源,進行凝膠成像觀察,與marker比較,確定片段大小。

用不同瓊脂糖濃度分離不同大小的DNA片段;