藥敏試驗的K-B法是將壹張浸有抗菌藥物的紙片按壹定要求貼在塗有細菌的瓊脂平板培養基上，培養壹段時間後，測量抑菌圈的大小，根據相關解釋標準對結果進行分析，從而得出被測菌株的藥敏結論。
1.待測菌株接種物的制備
(1)壹般情況:從過夜孵育的平板中，從哥氏血瓊脂平板上挑取幾個單菌落，直接接種4.5%生理鹽水制成菌懸液，用濁度儀將懸液的濁度調至0.5麥克斯韋單位，使菌懸液中含有相當於ATCC 25922 (1-2) * 6552的大腸桿菌。
(2)特例:嗜血桿菌(本程序中僅提及流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌):直接從過夜孵育的HTM平板中接種4.5%生理鹽水制成菌懸液，用濁度儀將懸液濁度調至0.5麥克斯韋單位，使菌懸液中含有相當於ATCC 25922 * 10106的大腸桿菌。
接種平板
(1)調整好懸液的濁度後，用無菌棉簽浸入懸液中，將棉簽在靠近試管內壁的液體上旋轉幾次，去除棉簽上多余的液體，但也要適度。
(2)用棉簽在整個瓊脂表面劃線，從平板的頂部到底部均勻塗抹。重復此過程兩次(壹次* * *三次)，每次旋轉平板約60度，保證接種菌液分布均勻。最後在瓊脂平板邊緣塗抹壹圈，防止菌懸液流動，將菌液塗在整個平板的每個角落。
(3)塗有菌液的平板可在室溫下放置壹段時間(3-5分鐘)，使瓊脂吸收表面多余的水分後再放入含藥紙，但時間不得超過15分鐘。
3.放置測試藥物敏感紙。
根據試驗菌的不同，按照預先設定的分組，在接種細菌的瓊脂表面粘貼抗菌藥物紙，每張紙都必須向下壓，保證與瓊脂表面完全接觸。無論是單獨放置的紙張還是帶有配紙設備的紙張，紙張都必須均勻分布，兩張紙張中心之間的距離不小於24mm，紙張邊緣到瓊脂邊緣的距離不小於15 mm。
我們房間用的MH盤，直徑90mm，放紙不超過5張。因為有些藥物幾乎瞬間擴散，紙壹旦接觸到瓊脂表面，就無法移動。如果位置不好，可以在瓊脂的另壹個位置放壹張紙。
孵化
(1)壹般情況:放紙後，在15分鐘內將MH瓊脂倒置放入培養箱(35℃)，孵育16 ~ 18小時(以下所列需要延長孵育時間的情況除外)。用KB紙片法檢測嗜血桿菌、淋球菌、腦膜炎奈瑟菌和鏈球菌的測試板應在含5% CO2的環境中孵育。
(2)延長培養:①檢測苯唑西林和頭孢西丁對葡萄球菌的敏感性時，培養時間必須達到24小時，以滿足判定結果的要求。②檢測萬古黴素對金黃色葡萄球菌和腸球菌的敏感性，孵育時間必須達到24小時。
5.抑菌圈直徑的測量
(1)壹般情況:35℃，孵育16 ~ 18小時後，將帶紙的MH平板放在黑色不反光背景上，用遊標卡尺測量抑菌圈直徑(完全抑菌圈直徑)。利用反射光和肉眼觀察，可以讀出離板背面最近的毫米數。
肉眼可見無明顯生長的部分為抑菌圈邊緣。壹般情況下，只有在放大鏡下才能觀察到的微小菌落出現在抑菌圈邊緣，可以忽略不計。
MH平板上的抑菌圈均勻、圓形，供試菌株在平板上呈現融合生長的苔蘚。如果單個菌落生長稀疏，說明接種時配制的菌液濃度太稀，需要找出可能的原因，重新檢測。
(2)特殊情況:①苯唑西林對葡萄球菌的抑菌圈:舉起平板，面對光源，利用透射光觀察苯唑西林紙周圍的抑菌圈內是否有細微菌落生長。如果有可識別的生長，應判斷為苯唑西林耐藥。
②利奈唑胺對葡萄球菌的抑菌圈:利用透射光，用遊標卡尺讀取抑菌圈的數值。③復方磺胺甲惡唑抑菌圈:MH平板中有壹定量的葉酸抑制劑的拮抗劑，會導致試驗菌輕微生長。因此，在測量復方磺胺甲惡唑抑菌圈直徑時，應忽略輕微生長(20%左右)，以明顯生長為抑菌圈界限。