纖維素酶是壹種重要的酶產品,它是壹種復合酶,主要由外切β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成,還有很高活力的木聚糖酶活力。纖維素酶在飼料、酒精、紡織和食品等領域具有巨大的市場潛力,將是繼糖化酶、澱粉酶和蛋白酶之後的第四大工業酶種,是酶制劑工業中的壹個新的增長點。
產纖維素酶的微生物有很多,迄今為止國內外***記錄了產纖維素酶的菌株大約53個屬的幾千個菌株,包括細菌、真菌和放線菌。目前,用於纖維素酶生產的主要是真菌類,世界纖維素酶市場中有20%是來自於木黴屬和曲黴屬,其中木黴屬被公認是產纖維素酶最高的菌種之壹,是當前生產上應用較多的菌種。
自從第二次世界大戰中Reese從美軍軍裝上發現了木黴,木黴纖維素酶的工業化生產越來越引起人們的重視,T.ressei成為世界範圍內最主要的纖維素酶生產菌株。它的優點在於具有培養粗放、適應性強的特點,適於固體培養和液態深層發酵,它的酶系纖維素酶活性高並且能生產大量的胞外蛋白,它的胞外纖維素系統由60%~80%的外切葡聚糖苷酶,20%~36%的內切葡聚糖苷酶和1%的β-葡聚糖苷酶組成,這些酶協同作用將纖維素轉換成葡萄糖。
誘變選育是提高菌株酶活的壹種有效方法,以T.ressei Rut C-30突變菌株為例,它是通過3步誘變得到的(覃玲靈等,2011)。首先,在代謝物抑制條件下,通過水解纖維素酶活的篩選,進行紫外線誘變,得到菌株M7;其次,通過化學誘變(亞硝基胍)和壹個過程與前者相似但更嚴格的酶活篩選之後,從M7中分離出了菌株NG14,在胞外蛋白和纖維素酶活力方面,NG14 與親本株以及其他可用的纖維素酶突變株相比都提高了幾倍(Eveleigh et al.,1979);最後,對NG14經過紫外線誘變,經過2-脫氧葡萄糖的抗性篩選後,得到菌株Rut C30(Kang et al.,2006;Wick et al.,1957)。Rut C30剛分離出來時纖維素酶的產量能夠達到15FP units/(L·h),能產出大約20mg/mL的胞外蛋白,與它的親本菌株NG14相比,胞外蛋白的產量多了2倍,達到2%,在工業發酵罐中的產量超過30g/L,達到了工業需求的酶產量;與其他木黴菌株相比,Rut C30產的外切葡聚糖苷酶穩定性最高,在pH5.0,50℃的條件下培養30d,只有28%的酶失活(Esterbauer H et al.,1991)。
T.ressei突變菌株QM9414,MCG77,MCG80,Rut C30,CL-847,VTT-D和SVG是生產完整纖維素酶系的優良菌株。當以上菌株在添加纖維素(如濾渣、棉、微晶纖維素等)或處理的木質纖維素(木材、稭稈)的無機鹽培養基中培養時,可以分泌產生纖維素酶(H.Esterbauera et al.,1991)。以上菌株在實驗室搖瓶發酵培養條件下,每消耗1 g碳源平均可產生250mg的纖維素酶蛋白,蛋白活性為0.5~1.0U/mg,產量為50~150FP units/(L·h),補料分批連續培養可增加酶的濃度和產量。
Mach和Seiboth等研究發現,以纖維素、木聚糖或者其他植物聚合物甚至乳糖等工農業副產品為培養基,木黴也可以產生高濃度的纖維素酶和半纖維素酶(Mach et al.,2003;Seiboth et al.,2007)。木黴屬纖維素酶近來已經工業化生產,除國際大品牌公司Genencor,NovoNordisk外,國內有湖南尤特爾酶制劑等公司已大規模生產纖維素酶。
木黴纖維素酶的發酵生產主要有兩種模式:固態發酵和液態發酵。
固體發酵法是以玉米等農作物稭稈為主要原料,其投資少,工藝簡單,產品價格低廉,目前國內絕大部分纖維素生產廠家采用該技術生產纖維素酶(乞永立等,2000)。中國科學院過程研究所陳洪章等在纖維素酶的固態發酵領域進行了研究,並設計了100m3的纖維素酶固態發酵反應器及其配套設備,實現了以汽爆稭稈為原料的纖維素酶的大型生產,最高產量達210FPA/g幹曲。然而固體發酵法生產的纖維素酶很難提取、精制。目前,我國纖維素酶生產廠家只能采用直接幹燥法粉碎得到固體酶制劑或用水浸泡後壓濾得到液體酶制劑,其產品外觀粗糙且質量不穩定,發酵水平不穩定,生產效率較低,易汙染雜菌。
液體發酵生產工藝過程是將玉米稭稈粉碎至20目以下進行滅菌處理,然後送發酵釜內發酵,同時加入纖維素酶菌種,發酵時間約為70h,溫度低於60℃。采用除菌後的無菌空氣從釜底通入進行通氣攪拌,發酵完畢後的物料經壓濾機板框過濾、超濾濃縮和噴霧幹燥後制得纖維素酶產品。液態深層發酵由於具有培養條件容易控制、不易染雜菌、生產效率高等優點,已成為國內外重要的研究和開發方向。李忠興等(1999)以T.koningii T215為菌種,在30t氣升反應器中進行了纖維素酶的發酵生產,平均CMC酶活達78.3IU/mL。
南京農業大學陸兆新等研究了用覆蓋不同高分子的紗布固定化木黴細胞纖維素酶的活性,其中覆蓋poly(HPMA)載體固定化木黴的纖維素酶活最高,達3.5IU/mL。用固定化木黴細胞產生的纖維素酶不經提純分離,直接水解輻射和低濃度NaOH預處理的稻麥稈,其葡萄糖產率隨輻照劑量和水解時間的增加而增加,電子輻射和4%NaOH處理的稻稈葡萄糖產率達19%,而麥稈達22%,認為固定化木黴細胞酶液能很好地水解輻射預處理的稻麥稈。該研究成果“輻射和生物技術相結合提高纖維素酶水解效率的基礎研究”在1999年獲農業部科技進步獎二等獎。
由於纖維素酶是多組分復合物,各組分的底物專壹性不同,而且不同來源的纖維素酶其組成及各組分的比例有較大的差異,致使纖維素酶活力的測定方法復雜而不統壹。傳統纖維素酶活測定方法很多,如微晶纖維素酶活測定方法、濾紙酶活(FPA)測定方法、水楊苷酶活測定方法、染色纖維素法、濾紙崩潰法、棉線切斷法、羧甲基纖維素鈉鹽(cmC-Na)酶活性測定方法、棉花糖法、CMC粘度降低法、熒光定糖法平板法等(尹娟等,2009)。利用新型傳感器測定纖維素酶活性已越來越多地應用於生產過程中,生物傳感器適應於復雜體系的實時及在線測定,具有快速測定、簡便易攜、高靈敏度、高專壹性,而且檢測樣品壹般可反復多次使用、不需另加其他試劑、不需要預處理、不要求樣品清晰度等優點,在監測與控制中顯示出巨大的優勢。