《貓和老鼠》的故事圍繞著壹對普通的家貓，老鼠湯姆和老鼠傑瑞展開。湯姆有壹種強烈的欲望，想抓住住在同壹房間的老鼠傑裏，並不斷試圖趕走討厭的房客。盡管湯姆總是失敗，但他更喜歡追逐而不是抓住傑裏。
同時，湯姆在影片中也經常使用斧頭、錘子、炸藥、鞭炮等暴力工具或陷阱來對付傑瑞。但傑瑞很聰明，有時湯姆的伎倆適得其反，讓湯姆吃了苦頭。在這部動畫中，沒有動物世界欺淩的殘酷，只有日常瑣事和兩個鄰居的爭執。
《貓和老鼠》以滑稽劇為特色，描繪了壹對冤家對頭:貓和老鼠之間的戰爭。影片中，湯姆經常用狡猾的伎倆對付傑裏，而傑裏則經常利用湯姆詭計中的漏洞來逃避他的迫害，並得到報復。