原則:
酵母雙雜交系統的建立是基於對真核生物調控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因的轉錄需要反式轉錄激活因子的參與。反式轉錄激活因子，如酵母轉錄因子GAL4，在結構上是模塊化的，並且通常由兩個或多個結構上可分離且功能上彼此獨立的結構域組成，包括DNA結合結構域(DNA-BD)和轉錄激活結構域(DNA-AD)。當兩個結合域分開後，它們仍有功能，但不能激活轉錄。只有當兩個分離的結構域在空間上相互靠近時，才能再現完整的GAL4轉錄因子活性，並能激活上遊激活序列的下遊啟動子(UAS)，從而轉錄該啟動子的下遊基因。
根據這壹特性，將編碼DNA-BD的基因和已知的蛋白誘餌蛋白的基因構建在同壹表達載體中，並在酵母中表達了它們的融合蛋白BD-誘餌蛋白。在AD文庫表達載體上構建編碼AD的基因和cDNA文庫。同時將上述兩種載體轉化到轉化酵母中，轉化酵母細胞的基因組既不能產生GAL4，也不能合成LEU、TRP、HIS和ADE，因此酵母不能在缺乏這些營養物質的培養基上正常生長。當上述兩種載體表達的融合蛋白可以相互作用時，功能重建的反式作用因子可以激活酵母基因組中的報告基因HIS、ADE、LACZ和MEL1，從而通過功能互補和顯色反應篩選出陽性菌落。提取並分離陽性酵母菌株中的AD文庫載體，以便對插入載體中的文庫基因進行測序和分析。