種子萌發過程中貯藏物質的動員,需要在壹系列酶的催化作用下才能進行。這些酶有的已經存在於幹燥種子中,有的需要在種子吸水後重新合成。種子萌發過程中澱粉的分解主要是在澱粉酶的催化下完成的。澱粉酶在植物中存在多種形式,包括α-澱粉酶、β-澱粉酶等。β-澱粉酶已經存在於幹燥種子中,而α-澱粉酶不存在或很少存在於幹燥種子中,需要在種子吸水後重新合成。實驗證明,啟動α-澱粉酶合成的化學信使是赤黴素。萌發的大麥種子的胚產生赤黴素擴散到胚乳的糊粉層中,刺激糊粉層細胞內α-澱粉酶的合成。合成的澱粉酶進入胚乳,將胚乳內貯藏的澱粉水解成還原糖。因此,沒有胚釋放赤黴素的活動,α-澱粉酶就不能合成。外加的赤黴素可以代替胚的釋放作用,從而誘導α-澱粉酶的合成。這個極其專壹的反應被用來作為赤黴素的生物鑒定法。在壹定範圍內,由去胚的吸脹大麥粒所產生的還原糖量,與外加赤黴素濃度的對數成正比。根據澱粉可與I2-KI顯藍色,而澱粉分解的產物還原糖不能與I2-KI顯色的原理,可以定性和定量地分析α-澱粉酶的活性。
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※<實驗材料、試劑與儀器設備>
(壹)實驗材料
大麥(或小麥)種子。
(二)試劑
1.1%次氯酸鈉溶液。
2、0.1%澱粉溶液:取1g澱粉和8.16g
KH2PO4,用蒸餾水配制成1000mL溶液。
3、2×10-5mol/L赤黴素溶液:稱取GA3
6.8mg放入燒杯中,加少量95%酒精使其溶解,移入1000mL容量瓶中,加水定容至刻度。然後再稀釋成2×10-6mol/L、2×10-7mol/L和2×10-8mol/L三種濃度的赤黴素溶液。
4、10-3mol/L醋酸緩沖液(pH4.8):取2mL
0.2mol/L的醋酸(11.55mL冰醋酸稀釋至1000mL)、3mL
0.2
mol/L的醋酸鈉(16.4g無水醋酸鈉配成1000mL)和1g鏈黴素,定容至000mL,每mL緩沖液中含鏈黴素1mg。
5、I2-KI溶液:取0.6gKI和0.06gI2溶於1000mL0.05mol/L的HCl中。
(三)
儀器設備
分光光度計,恒溫振蕩器,水浴鍋,2mL移液管1支,50mL燒杯2只,試管6支,青黴素小瓶6個,鑷子1把,刀片。
5
※<實驗步驟>
1.
取樣
選取大小壹致、完好的大麥或小麥種子50粒,用刀片將每粒種子橫切成有胚和無胚的半粒,分裝於2個燒杯中。
2.
表面消毒
向2個燒杯中加入1%次氯酸鈉溶液,以浸沒種子為度。消毒
15min後,用無菌水沖洗3次,備用。
3.
處理濃度
將6只青黴素小瓶編號後,按表40-1加入溶液和材料。溶液混勻後,1~6號小瓶中赤黴素的最終濃度分別為:0、0、2×10-5、2×10-6、2×10-7和2×10-8mol/L。將青黴素小瓶置於恒溫振蕩器中於25℃下振蕩培養24h。
表
40-1
處理濃度及方法
青黴素小瓶編號
赤黴素溶液
醋酸緩沖液(mL)
實驗材料
濃度(mol/L)
mL
1
0
1
1
10個無胚半粒
2
0
1
1
10個有胚半粒
3
2×10-5
1
1
10個無胚半粒
4
2×10-6
1
1
10個無胚半粒
5
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