菌種分離主要在培養皿上進行，常用的方法有稀釋法和劃線法。
菌種分離的目的是單個微生物通過繁殖在固體培養基上長出肉眼可見的菌落，然後根據培養特點，用接種針取回所需菌種，在顯微鏡下檢查，證明是單壹形狀的菌體。
改變培養基條件也有助於菌株分離。沒有壹種培養基或培養條件能滿足所有微生物生長的需要，所有的培養物都有壹定的選擇性。
如果微生物的生長需求是已知的，也可以設計適合該微生物生長的特定環境，從而可以從混合微生物群體中選擇性培養該微生物，盡管該微生物在混合微生物群體中可能只是少數。
第二，方法
1，稀釋倒置平板法
先將微生物懸液進行系列稀釋(如1:10，1:100，1:1000，1:10000)，然後再將微生物懸液單獨稀釋。
如果適當稀釋，可在平板表面或瓊脂培養基中出現分散的單個菌落，這可能是由細菌細胞的繁殖形成的。然後挑單菌落，或者重復幾次以上操作，就可以得到純培養。
2、塗布平板法
因為先在熱培養基中加入微生物懸液再倒平板容易導致壹些熱敏菌的死亡，而稀釋倒平板法也會因為固定在瓊脂中缺氧而影響壹些嚴格需氧菌的生長，所以微生物學研究中常用的純種分離方法是塗布平板法。
方法如下:首先將融化的培養基倒入無菌培養皿中，制成無菌平板；冷卻固化後，將壹定量的微生物懸液滴在平板表面；然後用無菌玻璃塗抹棒將菌液均勻分散在平板的整個表面；培養後，選擇單菌落。
3、平線法
分離微生物最簡單的方法是平板劃線法，即在無菌操作中，用接種環蘸取少量待分離物質，在無菌平板表面連續劃線，使微生物細胞數量隨劃線次數的增加而減少，並逐漸分散。如果劃線合適，可將微生物逐個分散，培養後可在平板表面獲得單菌落。
有時候這個單菌落並不都是單個細胞繁殖的，所以必須反復分離才能得到純物種。其原理是將微生物樣品在固體培養基表面由點到線進行多次稀釋，達到分離的目的。畫線的方法很多，常見的容易出現單菌落的畫線方法有斜線法、曲線法、網格法、放射法、四網格法等。
4、稀釋搖管法
用固體培養基分離嚴格厭氧菌是特殊的。如果微生物暴露在空氣中後沒有立即死亡，可以通過通常的方法將其制備成平板，然後置於密閉容器中進行培養。容器中的氧氣可以通過化學、物理或生物方法去除。
對於那些對氧更敏感的厭氧微生物，純培養物的分離可采用稀釋搖瓶培養法，這是稀釋倒平板法的壹種改進形式。
首先將壹系列裝有無菌瓊脂培養基的試管加熱使瓊脂融化，然後冷卻並保持在50℃左右。待分離的物質用這些試管梯度稀釋，試管快速搖勻。冷凝後，將壹層滅菌的液體石蠟和固體石蠟的混合物倒在瓊脂柱表面，將培養基與空氣隔開。
培養後，在瓊脂柱中間形成菌落。挑取並移植單菌落，需要用無菌針頭取出液體石蠟-石蠟蓋，然後在瓊脂與管壁之間插入毛細管，吹入無菌無氧氣體，吸出瓊脂柱，放入培養皿中，用無菌刀將瓊脂柱切片，進行觀察和菌落移植。
擴展數據
在上述方法中，平板分離法廣泛用於實驗室微生物的分離純化，稀釋法常用於液體培養基的分離純化。
壹般來說，通過適當改善培養基的條件可以培養出特征菌株。
比如為了獲得嗜熱微生物，可以在50℃~60℃培養。有時加入相應的抑制劑也能提高菌株的分離效果。例如，在土壤樣品的懸浮液中加入幾滴10%的苯酚，可以抑制黴菌和細菌的生長，有利於放線菌的分離。在培養基中添加壹定量的青黴素或鏈黴素，可以抑制細菌的生長，有利於黴菌的分離。
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