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PCR產物的檢測方法有哪些?

PCR產物的檢測方法:

瓊脂糖凝膠電泳

這是實驗室最常用的方法,簡單易行,實驗只需要少量的DNA。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時,由於遊動速度不同而分離,用溴化乙錠(EB)染色,DNA分子在紫外光下發出熒光,從而確定其分子大小。?

PCR產物電泳檢測用的瓊脂糖濃度往往是1%-2%,要用高純度的電泳級瓊脂糖,已經去除了熒光抑制劑、核酸酶等雜質。

(1)制膠

瓊脂糖凝膠的厚度約為3 ~ 5 mm,太薄樣品會溢出,太厚熒光穿透力不強,以至於壹些細小的DNA條帶難以分辨。如果制備了100ml的2%凝膠,稱取2g瓊脂糖於三角瓶中,加入100ml?0.5×TBE溶液,微波2-5min使瓊脂糖完全溶解(註意不要煮沸)。當室溫降至60℃時,加入終濃度為0.5μg/ml的EB溶液,混勻後倒板(註意不要除氣)。

(2)樣品添加和電泳

上樣時,壹般取5 ~ 10μl PCR反應液,加入3μl溴酚藍溶液,混勻後加入凝膠上樣孔。電泳儀可以是通用的穩壓可調中壓電泳儀,電泳工作液為0.5×TBE溶液。當連接電源時,樣品從負電極移動到正電極。60-100V恒壓電泳約30-60分鐘。

(3)檢測

將凝膠板置於紫外透射儀的應時玻璃臺上進行檢測,DNA產物與熒光染料EB形成橙黃色熒光復合物。觀察每個泳道中是否有橙色熒光帶,擴增時與陽性對照集比較,判斷陽性或陰性結果。電泳時以標準分子量為對照,也可以判斷擴增片段是否與設計大小壹致。

聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳復雜,但常用於引物純化、PCR擴增指紋圖譜、多重PCR擴增和PCR擴增產物的限制性長度多態性分析。

聚丙烯酰胺凝膠電泳分離DNA片段的有效範圍:

(1)制膠

在兩塊制膠玻璃板之間墊上墊片,放上制膠框,擰緊制膠螺絲,將玻璃板夾緊。

準備適量濃度合適的凝膠,比膠板略多。100μl體積凝膠的制備方法見下表。?

不同濃度(%)聚丙烯酰胺凝膠的制備:

加入TEMED和10%過硫酸銨後,立即混合均勻,倒入45℃角放置的玻璃盤中,填滿(註意不要有氣泡),迅速將玻璃盤水平放置。立即將塑形梳放在腔體頂部並夾緊。膠聚合30-60分鐘後,取下膠板,放入電泳槽中固定。

(2)樣品添加和電泳

在上下槽中加入1×TBE電泳緩沖液,溢出加樣孔,拔出梳子,排出加樣孔中的氣泡。將PCR產物或限制性內切酶消化產物2與1加樣緩沖液混合,用微量註射器加到加樣孔底部,使樣品在孔底形成壹層。在兩邊的孔中加入標準分子量的DNA。馬克筆.

在2-10V/cm的電壓下進行電泳,電泳時間足夠長,使片段分離。當指示器到達合適的位置時,關閉電源,取出膠片。

(3)銀染

將兩塊玻璃板分開,將凝膠片放入100ml銀染固定液中,搖勻15min,雙蒸洗3次,每次2min,然後將凝膠片轉移至100ml?在搖床上用0.2% AgNO3染色約65438±00分鐘,吸取AgNO3溶液,用雙蒸水洗滌3次,每次30s,加入65438±000ml顯色液約7-65438±00分鐘,待DNA條帶清晰後,吸取顯色液,加入固定液Na2CO3,靜置2-3min,取出。