酵母雙雜交原理

與題目不符，但希望可以作為參考。1.實驗原理酵母的生活史屬於二態性類型，其單倍體細胞和二倍體細胞壹般可以無限分裂。具有單倍體細胞的酵母稱為單倍體酵母，如裂殖酵母。具有二倍體細胞的酵母稱為二倍體酵母，如釀酒酵母。這兩種酵母常被用作基因研究的材料，啤酒酵母在釀酒工業和食品工業中有很大的應用價值。本實驗采用異宗配合型啤酒酵母單倍體菌株進行雜交。任何壹株酵母，如果二倍體營養細胞處於產孢條件下，都會發生減數分裂，產生四分體和子囊菌。每個子囊孢子都有壹個四分子核。正常情況下，子囊中有四個子囊孢子，包括兩個A和兩個α，A和α代表兩個相反的接合型。具有這兩種接合的子囊菌萌發生長成單倍體菌株，具有不同接合的單倍體菌株結合產生二倍體菌株。具有這種生活史的酵母稱為異宗配合酵母。異宗配合啤酒酵母的生活史如圖11-1所示。單倍體品系屬於兩個接合，A和α，由壹對等位基因A和α控制，其基因座在第三連鎖群中的著絲粒附近。在光學顯微鏡下觀察酵母的染色體非常困難，但在電子顯微鏡的幫助下，我們對酵母的細胞學有了更多的了解。已知啤酒酵母有17個連接基團(n=17)。屬於不同合子營養缺陷型的兩個酵母單倍體菌株不能在基本培養基上形成菌落。當它們雜交形成二倍體雜交細胞時，它們可以在基本培養基上生長。在形成子囊孢子的過程中，二倍體雜交細胞發生染色體重組，導致產生的子囊孢子發生重組。2.實驗目的通過酵母雜交實驗，了解異宗配合型啤酒酵母的生活史和基因自由組合規律，掌握酵母雜交的基本方法。三、實驗材料1。啤酒酵母的單倍體腺嘌呤缺陷型(ade-)，接合型為A；2.釀酒酵母的單倍體組氨酸缺乏型(Hisl-)，接合型為α。四、實驗儀器及藥物1。儀器:試管、離心管、離心機、吸管、培養皿、三角燒瓶、塗桿、石英砂。2.藥物:生理鹽水(0.85g NaCl溶於100ml蒸餾水中，15blb消毒15min)，纖維素酶或蝸牛酶。3.培養基:(1)完全液體培養基:蛋白腖2g，酵母浸泡母液1g，葡萄糖2g，水100ml，pH6.0，8 lbs滅菌30min。(2)完全固體培養基:在完全液體培養基中加入2%瓊脂。(3)基礎液體培養基:葡萄糖10g，(NH4)2SO41+0g，K2HPO40.125，KH2PO40.875，KI*母液1ml，MgSO4 7H2O0.5，CaCl2 2H2O 0.65g..微量元素母液**1 ml，維生素母液* * 1 ml，水1000 ml，pH5.3，8 lbs滅菌30分鐘。*碘化鉀母液:10毫克碘化鉀溶於100毫升水中。* *微量元素母液:H3PO41mg，ZnSO4 7H2O7 7mg，cuso 4·5H2O 1mg，CoCl2 6H2O5 5mg，水100ml。* * *維生素母液:煙酸40毫克、B140毫克維生素B、肌醇200毫克、核黃素20毫克、對氨基苯甲酸20毫克、吡哆醇40毫克、泛酸40毫克、生物素0.2毫克、水100毫升。(4)基本固體培養基:在基本液體培養基中加入2%瓊脂。(5)產孢培養基:ch 3c oona 8.2g，KCl 65438 0.86g，*吡哆醇酵母液1ml，*泛酸母液1ml，*生物素母液1ml，瓊脂20g，蒸餾水1000ml。*吡哆醇母液:20毫克吡哆醇/100毫升水。* *泛酸母液:20mg泛酸/100ml。* * *生物素母液:生物素2mg/100ml。(6)補充培養基:a .基本固體培養基100 ml，含組氨酸3.5 mg。b .基礎固體培養基100 ml加3 mg腺嘌呤。5.實驗步驟1。取4支培養基斜面完全固體的試管。將ade-和Hisl-分別接種在兩個斜面上。在30℃培養24小時。2.用5 ml生理鹽水洗掉壹個ade斜面上的細菌，然後倒入另壹個ade試管中，最後將洗好的細菌倒入無菌離心管中。另外取5 ml生理鹽水沖洗Hisl- 2試管斜面上的細菌，倒入無菌離心管中。這樣制備的菌液濃度約為108/ ml。3.吸取各親本菌液0.5ml，放入5ml完全液體培養基中，30℃保溫2h。4.離心(3,000 rpm，3分鐘)，30℃培養半小時。5.倒出上清液，將管底的菌塊打勻，加入6 ml新鮮的完全液體培養基，30℃培養過夜。6.離心，倒出上清液。加入6 ml新鮮的完全液體培養基，洗滌壹次，離心，倒出上清液。7.將離心管中沈澱的細菌接種在產孢培養基斜面上，30℃培養2-3天。在顯微鏡下，我們可以看到雜交後形成的子囊菌中有4個子囊孢子。8.確定子囊孢子的表型並推斷其基因型:(1)在有子囊菌的斜面上加入2ml基礎培養液，用接種環刮去子囊菌，倒入無菌離心管中。(2)在55-60℃恒溫水浴中加熱65438±05分鐘，殺死酵母的營養體，即單倍體細胞。離心，倒出上清液，加入生理鹽水至原體積，形成ascus懸液。(3)將孢子懸浮液倒入裝有石英砂的滅菌三角瓶中，搖動5分鐘，使子囊孢子分散，成為子囊孢子懸浮液。(4)取0.1 ml分散的子囊孢子懸液，塗於完全培養皿上，30℃培養48小時。(5)影印培養:以上述培養皿為原培養皿，依次影印:a .基礎培養基；b .腺嘌呤補充培養基；c .組氨酸補充培養基；d .完全培養基。在30℃培養48小時。(6)生長譜的鑒定:a .從原始培養皿中選擇已初步鑒定的每個菌落，接種在完全培養基的斜面上。同時將其接種於裝有5ml液體完全培養基的離心管中，於30℃培養48h。b .離心機(3000轉/分，3分鐘。)，倒出上清液，均勻沈澱，然後離心洗滌三次，最後加入生理鹽水至原體積。c .吸取0.1 ml菌液，轉移至空的無菌培養皿中。然後倒入融化後冷卻至40-50℃的固體基礎培養基中，搖勻，等待凝固。各做1道菜。d .將每個培養皿的底部分成四個隔室，其中兩個隔室含有少量組氨酸晶體粉末，另外兩個隔室含有少量腺嘌呤晶體粉末。然後放在30℃的培養箱裏培養48小時。e .觀察生長，營養缺陷型菌株會圍繞所需物質生長。如果需要兩種物質，它們只能在兩種物質都擴散的地方生長。操作步驟見圖11-2。9.實驗步驟說明:(1)步驟3-6是用營養豐富的培養基培養新鮮細胞，使不同接合類型的細胞充分接觸形成合子，從而為孢子產生創造條件。(2)在步驟7中，因為酵母不會在產芽孢培養基上增殖，所以需要接種足夠的細胞，使得雜交形成的孢囊不會太少。(3)步驟8(3):為了從子囊菌中獲得子囊孢子，也可以用蝸牛酶充分處理子囊菌，然後用超聲波處理以充分分散子囊孢子。蝸牛酶處理的溫度為30-37℃，時間為15-30分鐘。在沒有蝸牛酶的情況下，用石英砂振搖也能使子囊菌破裂，散出子囊孢子。(4)酵母是單細胞真菌，不形成菌絲，因此在步驟8(5)中可以采用影印法。6.實驗結果是1。影印結果:能長帶“+”不能長帶“-”，計數菌落數。2.生長光譜鑒定:3。對比影印和生長光譜鑒定的結果，看結論是否壹致。4.實驗結果表明，本實驗所用的釀酒酵母營養缺陷型單倍體菌株的ade和Hisl基因屬於不同的連鎖群，是兩對基因的自由組合。因此，在實驗結果中，單體型比為+∶阿德-∶ HISL-∶阿德-HISL-= 1 ∶ 1 ∶ 1。單倍體品系的表型比例也應該是1:1:1:1。表型分離比直接反映了基因型的分離比。