向“平板計數法”求助的標準步驟

1.操作方法:無菌操作取25g(或25ml)供試品，置於225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液(瓶中預置適量玻璃珠)的滅菌玻璃瓶或滅菌研缽中，充分搖勻或研磨，制成1: 10的均勻稀釋液。加入稀釋液後，最好將固體樣品放入滅菌均質機中，以8000~10000r/min的速度處理1min，制成1: 10的均勻稀釋液。用1ml無菌移液管吸取1: 10稀釋液，沿管壁緩慢註入裝有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管中，搖動試管混勻，制成1: 100稀釋液。再取1ml無菌吸管，按照上述操作順序進行10倍的增量稀釋，這樣每次增量稀釋將使用1根無菌吸管。2.無菌操作:手術中必須運用“無菌操作”的理念，所用的玻璃器皿必須經過徹底消毒，不能有細菌或抑菌物質殘留。使用的剪刀、鑷子等器械也必須消毒。如果樣品是有包裝的，在包裝的開口處用75%的乙醇擦拭，然後取樣。操作應在消毒後的潔凈工作臺或無菌室進行。瓊脂平板在工作臺上暴露15分鐘，每板不得超過15個菌落。3.取樣的代表性:如果是固體樣品，取樣不宜集中，多取幾份。固體樣品必須均質化或研磨，液體樣品必須搖動以獲得均勻的稀釋劑。4.樣本稀釋誤差:為了減少樣本稀釋誤差，應充分搖動每種稀釋液，使其在連續稀釋過程中均勻，每次稀釋應更換吸管。連續稀釋時，移液管內的液體應沿管壁流入，移液管尖端不應伸入稀釋液中，以免粘附在移液管外側的溶液溶解在其中。為了減少稀釋誤差，SN標準取10mL稀釋液，註入90mL緩沖液中。5.稀釋液:樣品稀釋液以滅菌生理鹽水為主，部分使用磷酸鹽緩沖液(或0.1%蛋白腖水)，對食品中受損的細菌細胞有壹定的保護作用。滅菌蒸餾水可用於稀釋含鹽量高的食物(如醬油)。1.操作方法:根據標準要求或對汙染情況的估計，分別選擇2~3個合適的稀釋度，同時做10倍的遞增稀釋，將1毫升稀釋液轉移到有吸收稀釋液的吸管的滅菌皿中，每個稀釋度做兩個皿。將冷卻至46℃營養瓊脂培養基註入約65438±05ml的培養皿中，旋轉培養皿並混合均勻。同時將營養瓊脂培養基倒入無菌平板中，加入1毫升稀釋液(無樣本)作為空白對照。瓊脂凝固後，將平板翻轉，置於36±65438±0℃的恒溫箱中48±2h，取出並計算平板中的菌落數，乘以稀釋倍數，得到每克(ml)樣品中所含的菌落總數。2.用於灌註的培養基應在46℃的水浴中保溫。如果溫度過高，會影響細菌的生長。溫度過低，瓊脂容易凝結，不能與菌液充分混合。如果沒有水浴，與其用皮膚燙，不如感覺燙。傾註介質的量不壹，12~20ml不等，壹般以15ml為宜。板太厚會影響觀察，板太薄容易幹。傾倒時，如果培養基底部有沈澱物，應丟棄底部，以免與菌落混淆，影響計數觀察。3.為了使平板上的菌落分布均勻，在平板上加入試液後，應盡快倒入培養基並旋轉混合均勻，可正反向旋轉。將測試樣品稀釋到最後壹個平板所用的時間不應超過20分鐘，以防止細菌死亡或繁殖。。4.養殖溫度壹般為37℃(水產品因其生活環境水溫較低，養殖溫度壹般為30℃)。培養時間壹般為48小時，有些方法只需培養24小時即可計數。培養箱應保持壹定的濕度，瓊脂平板培養48小時後，培養基失重不得超過65438±05%。5.為了避免食物中的微小顆粒或培養基中的雜質與細菌菌落混淆，很難區分。同時可以用稀釋液和瓊脂培養基混合做成平板，放在4℃的環境中不培養，以便計數時做壹個對照觀察。在某些場合，為了防止食物顆粒與菌落混淆，可在營養瓊脂中添加三苯基四唑氯化物(TTC)，培養後菌落呈紅色，易於分離。1.操作方法:培養時間結束後，計數每個平板上的菌落數。可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。記錄每個平板的菌落總數後，計算相同稀釋度下每個平板的平均菌落數，計算原樣品中每克(或毫升)的菌落數，並報告。2.當達到規定的培養時間時，應立即計數。如果不能立即計數，應在0-4℃下放置不超過24小時。3.計數時應選擇菌落數在30~300之間的平板(SN標準要求25~250個菌落)。如果在30~300之間有兩次稀釋，應按國標方法測定。比值小於等於2，取平均值。如果比值大於2，則報告較小的數(有些規定不考慮比值，全部報告為平均值)。4.如果所有稀釋都不在計數範圍內。如果它們都大於300，則將最高稀釋度的平均菌落數乘以稀釋倍數並報告。如果都小於30，最低稀釋度的菌落平均數乘以稀釋倍數。如果菌落數大於300且小於30，但不在30和300之間，則應通過將最接近300或30的菌落平均數乘以稀釋倍數來報告。如果在所有稀釋度中都沒有菌落生長，則應報告為小於1乘以最小稀釋倍數。壹些法規報告了根據估計值在上述情況下計算的菌落數。5.不同稀釋度的菌落數應與稀釋倍數成反比(相同稀釋度的兩個平板菌落數應基本接近)，即稀釋倍數越高，菌落數越少，稀釋倍數越低，菌落數越多。如果出現了反現象，應該算是檢驗中的失誤(有些食品有時可能會出現反現象，比如酸性飲料等。)且不應用作樣本計數報告的基礎。6.當平板上有鏈狀菌落生長時，如果鏈狀生長的菌落之間沒有明顯的界限，則應算作壹個菌落。如果有幾個不同來源的鏈，每個鏈都應算作壹個菌落。不要單獨計算鏈上生長的每個菌落。如果有片狀菌落生長，這種平板壹般不適合。如果片狀菌落少於半個平板，另壹半均勻分布，則半個平板的菌落數可以乘以2來代表整個平板的菌落數。7.當計數板菌落數過多時(即所有稀釋度均大於300)，但分布非常均勻時，可按半板或1/4計數。然後乘以相應稀釋倍數作為平板的菌落數。8.菌落數的報告，按照國標方法，菌落數在1 ~ 100之間時，應按實際數字報告；大於100時，應報告前兩位有效數字，第三位數字四舍五入計算。固體醫療樣品以克(g)報告，液體醫療樣品以毫升(ml)報告，表面塗片以平方厘米(cm)報告。