1.1實驗材料
脫毒紫蒜(隴南成縣)。
1.2實驗儀器
設備電子天平、高速冷凍離心機、紫外可見分光光度計、熒光燈、水浴鍋、刻度試管、離心管、燒杯、容量瓶、刻度移液管、透析袋等。
1.3實驗試劑
硫堇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、蛋氨酸(Met)、NBT、核黃素、蔗糖、蒽酮、乙酸乙酯、濃硫酸等。
2實驗方法
2.1大蒜超氧化物歧化酶的提取及活性測定
2.1.1粗提方法取10g脫毒大蒜於預冷的研缽中，加入適量提取介質，在冰浴中研磨成勻漿，再加入提取介質洗滌研缽，使終體積為200ml。取100ml，4℃離心10000 rmin-1 15min，上清液為SOD粗提物。
2.1.2純化方法硫酸銨研磨，加入SOD提取液使其達到50%飽和度，4℃冰箱放置30min，10000 rmin-1冷凍離心20min，去除外源蛋白。然後向上清液中加入硫酸銨至90%飽和，置於4℃冰箱中2h，置於65438。
2.1.3顯色反應取4支透明度好、質地相同的試管，2支用於測定，2支用於對照(見表1)。混合後，用比試管略長的雙層黑紙板套遮擋1對照管，同時置於4000xl日光下反應20 ~ 30 min(要求各管光照條件壹致，反應溫度控制在25 ~ 35℃之間，反應時間根據酶活性適當調整)。
2.1.4 SOD活性的測定和計算反應結束後，用黑布蓋好試管，終止反應。以遮光對照管為空白，在560nm波長處測量各管吸光度，按下式計算SOD活性:SOD活性=(A0-As)×vt/A0×0.5×fw×v 1；SOD比活性=SOD總活性/蛋白質濃度。公式中，總SOD活性表示為每克鮮重的酶單位；比活性單位表示為每毫克蛋白質單位和酶單位mg-1。A0負責控制管的光度吸收值；AS樣品管的光吸收值；VT樣品溶液的總體積(ml)；V1測定時的樣品用量(ml );FW樣品鮮重(g)；蛋白質濃度的單位是每克鮮重的蛋白質毫克數(mgg-1)。
2.2蒽酮比色法測定大蒜中的可溶性糖
2.2.1標準曲線制作
2.2.1.1.1%蔗糖標準溶液將分析純蔗糖於80℃烘至恒重，準確稱取1.000g，加入少量水溶解，然後加入0.5ml濃硫酸，轉移至100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。
2.2.1.2 100μg/L蔗糖標準溶液準確吸取1%蔗糖標準溶液1ml，加入100ml容量瓶中，加水至刻度。
2.2.1.3制作蔗糖標準曲線取11支20ml校準試管，分別從0到10編號，按表2加入溶液和水。然後向試管中依次加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯試劑和5ml濃硫酸，充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，逐壹精確保溫65438±0min，取出後自然冷卻至室溫，以空白為參比，在630nm波長處測定其吸光度，以吸光度為縱坐標，糖含量為橫坐標，繪制標準曲線，求解標準線性方程。
2.2.2提取可溶性糖
取新鮮脫毒大蒜，擦去表面汙垢，稱取3.0g，***3份，研磨。放入三個帶刻度的試管中，加入5 ~ 10 ml蒸餾水，用塑料薄膜密封，在沸水中提取30min(兩次)，將提取液過濾至25ml容量瓶中，反復沖洗試管和殘渣，定容至刻度。
顏色測定
吸取0.5ml樣品提取液於20ml刻度試管中(重復三次)，加入1.5ml蒸餾水。以下步驟與標準曲線測定相同，測定樣品的吸光度，計算可溶性糖的含量。
結果的計算
根據標準線性方程計算含糖量(μg ),並根據下列公式計算測試樣品的含量。
可溶性糖含量=(回歸方程得到的糖量/吸收的樣品溶液體積)×提取液量×稀釋倍數)/(樣品幹重× 106 )× 100%。
2.3大蒜素的提取、分離和測定
2.3.1實驗流程:大蒜脫毒→去皮→清洗→搗碎→酶解→溶劑提取→固液分離→上清液→減壓濃縮→大蒜濃縮液。
2.3.2實驗原理大蒜素為淡黃色油狀液體，微溶於水，易溶於乙醇、苯、乙醚等溶劑。利用這壹特性，可以用溶劑提取大蒜油。溶劑的選擇很重要，要求溶劑有足夠的溶解度，浸出後易於分離(沸點差異顯著)，盡量不含其他不良氣味和溶劑殘留。由於大蒜油多用於食品領域，所以選擇了揮發性強、對人負面影響小的乙醇作為提取劑。
2.3.3不同提取條件下乙醇體積分數、乙醇添加量、提取溫度和提取時間對大蒜素得率的影響。
2.3.4采用分光光度法測定大蒜素。
3實驗結果及分析
3.1脫毒大蒜超氧化物歧化酶的分離及活性測定
通過從脫毒大蒜中粗提SOD，用硫酸銨鹽析法初步純化SOD，用透析法純化SOD。最後，用分光光度法測定SOD活性。結果表明(見表3):重復實驗後，測定SOD活性，在560nm處的平均吸光度值A0(對照管的光度吸光度值)為0.091；AS(樣品管的吸光值)的平均值分別為0.0174、0.014和0.0157。計算出平均SOD活性為5.460，其SOD比活性為546U/mg。
3.2脫毒大蒜多糖含量的測定
3.2.1蔗糖標準曲線的制作采用梯度濃度稀釋法，配制20ug/mL、40ug/mL、60ug/mL、80ug/mL和100ug/mL的蔗糖溶液，分別在630nm處測量其吸光度值，然後根據各自的吸光度值繪制蔗糖標準曲線。具體吸光度值和標準曲線見表4和圖1。根據標準曲線，標準曲線為y(蔗糖濃度ug/mL)=0.0059x(吸光度值A)-0.0238，相關性為R2=0.9975。表明該標準曲線在蔗糖濃度為0-65438±000微克/毫升的範圍內是可行的。
3.2.2脫毒大蒜中可溶性糖的含量用蒽酮比色法測定脫毒大蒜中可溶性多糖的含量，結果表明(見表5):在630nm處測定大蒜中6種重復可溶性糖的吸光度值，吸光度值A在2.67-2.992範圍內。經計算，脫毒大蒜中可溶性糖的平均含量為485.75ug/mL。
3.3大蒜素的提取、分離和測定
3.3.1乙醇體積分數對大蒜素得率的影響取100g去皮鮮蒜，平均分成5份，40℃加熱1h，然後在30℃下分別加入體積分數為95%、90%、85%、80%、75%的乙醇80 mL。真空蒸餾後測定產物中大蒜素的含量，結果見表6。從表4可以看出，隨著乙醇體積分數的增加，大蒜素的產量也在增加，這也說明大蒜素易溶於有機溶劑，難溶於水。實驗表明，當乙醇體積分數為95%時，大蒜素的得率最高，達到0.037g/20g。
3.3.2乙醇添加量對大蒜素產量的影響:將100 g脫毒大蒜用適量磷酸鹽緩沖液搗碎，40℃水浴1 h，平均分成5份，然後分別按40 ml、60 ml、80 ml、100 ml、120mL加入30℃95%乙醇。從表5可以看出，乙醇的加入對大蒜素的產量有很大的影響。隨著料液比的增加，大蒜素的產量逐漸增加，但大蒜素的提取率從40mL到100mL增加很快，100mL後增加緩慢，這是因為隨著料液比的增加。大蒜素的提取率最終會趨於壹個極限值，這個極限值符合大蒜素在水相和有機相中的分配系數。綜合考慮原料和能耗等諸多因素，100g大蒜用100mL 95%乙醇提取效率最佳，大蒜素含量為0.039g/20g。
3.3.3提取溫度對大蒜素得率的影響取100g去皮鮮蒜，平均分成5份。分別加入適量的磷酸鹽緩沖液研磨，40℃水浴65438±0h，然後加入65438±000mL 95%乙醇在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃提取65438±0.5h，在50℃減壓蒸餾，測定餾出液中大蒜素的含量。從表6可以看出，大蒜素的提取率隨著提取溫度的升高而降低。這是因為溫度越高，大蒜素越不穩定，轉移到有機相中的大蒜素越少。當提取溫度為30℃時，大蒜素的提取率最高，含量達到0.038g/20g。
3.3.4提取時間對大蒜素得率的影響取100g去皮鮮蒜，平均分成5份，分別加入適量磷酸鹽緩沖液，40℃研磨1h，然後加入80ml 95%乙醇，在30℃分別提取1h、1.5h、2h、2.5h、2h、2h。從表7可以看出，隨著提取時間的延長，大蒜素的提取率先增大後減小。這應該是因為萃取時間太短，生成的大蒜素不能完全轉移到有機相中；如果時間過長，大蒜素很容易轉化為其他副產物。實驗證明，當提取時間為65438±0.5h時，大蒜素的提取率最高，達到0.038g/20g。
綜上所述，實驗證明蒜泥在40℃提取65438±0h，以65438±000ml的95%乙醇為提取劑，在30℃提取65438±0.5h，大蒜素的最高提取含量為0.038g/20g(0.65438±090%)。