商品及服務稅-下拉原則
？GST下拉實驗是基於GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)，即谷胱甘肽-S-轉移酶蛋白，可與谷胱甘肽結合。將GSH固定在瓊脂糖珠上形成GSH-瓊脂糖珠，通過與GST融合表達已知的蛋白質X。獲得的GST-X可以與GSH-瓊脂糖珠結合。如果環境中有蛋白質Y與蛋白質X相互作用，就會形成“瓊脂糖珠-GSH-GST-X-Y”復合物，可以分離檢測與蛋白質X相互作用的蛋白質。
GST下拉實驗方法
(基於鐘鼎的實驗案例，驗證預測的兩種蛋白質之間的相互作用)
試驗設計
表1拉下實驗系統
編號1 2 3 4
商品及服務稅++
B-His-+-+
商品及服務稅- +-
試驗設計
1.IPTG誘導pET28a-B-His和pGEX-4T-1-A載體融合蛋白的表達。
將1.1的表達載體轉化到大腸桿菌Rosseta中；
1.2選擇轉化板上的單克隆抗體，接種於含有50 μg/mL Amp的3 mL LB培養液的試管中，37℃搖勻過夜，制成種子液；
1.3次日，將1:100接種於含50 μg/mL Amp的30 mL LB培養基中，37℃搖床至OD600為0.8。
菌液中加入1.4 IPTG至終濃度0.5 mM，11~28℃振蕩培養，誘導融合蛋白表達4 ~ 8小時；
1.5離心菌液，棄去上清液，細菌沈澱用PBS重懸，超聲波破碎，離心取上清液；
1.6吸取少量上清液進行SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達。
2.細胞破碎和蛋白質純化
分別通過超聲波破碎、GST柱親和純化和Ni柱親和純化獲得純化的目的蛋白。
2.1 GST柱純化
(1)使用低壓層析系統，將細胞裂解上清液加載到GST親和層析柱上，GST結合-緩沖液預平衡；
(2)用GST結合緩沖液洗滌色譜柱，直到流出液的OD280值達到基線；
(3)用GST洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，收集流出液；
(4)將收集的蛋白溶液加入透析袋中，用Tris-HCl透析過夜；
(5) SDS-PAGE分析和WB分析。
2.2鎳柱凈化
(1)使用低壓層析系統，將細胞裂解上清液加載到具有Ni-IDA結合緩沖液預平衡的Ni-IDA -Sepharose Cl-6B親和層析柱上；
(2)用Ni-IDA結合緩沖液洗滌色譜柱，直到流出液的OD280值達到基線；
(3)用Ni-IDA洗滌緩沖液洗滌色譜柱，直至流出液的OD280值達到基線；
(4)用Ni-IDA洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，收集流出液；
(5)將收集的蛋白溶液加入透析袋中，用Tris-HCl透析過夜；
(6) SDS-PAGE分析和WB分析。
3.GST-下拉實驗
使用Gst蛋白質相互作用下拉試劑盒(購自Thermo company)。
3.1平衡樹脂(GST)
(1)將固定化谷胱甘肽混合均勻，使樹脂完全重懸；
(2) 100每個？將L 50%樹脂懸液置於4個離心管中，1250 ×g離心2 min，棄去上清液；
(3)用500？l將樹脂重新懸浮在PBS中，在1250 ×g離心2分鐘以去除上清液，並重復3次。
3.2蛋白質相互作用
(1)按表1分別向谷胱甘肽樹脂中加入A-GST蛋白和B-His蛋白，4℃下旋轉混合，孵育過夜；
(2)1250×g離心5 min後，棄去上清液(上清液要清洗幹凈)；
(3)用500？PBS重懸浮樹脂。用1250×g離心2分鐘，棄去上清液。重復3次。
3.3誘餌蛋白和目標蛋白復合物的洗脫
(1)加50？l洗脫緩沖液；
(2)在2)4℃下旋轉和混合，並孵育20分鐘；
(3)在1250× g離心2分鐘，棄去上清液，將離心後的液體置於冰上；
④拿20？l樣品用SDS-PAGE和WB檢測。
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