(1)瓊脂糖凝膠電泳簡單快速,樣品無需預處理即可電泳。
(2)瓊脂糖凝膠結構均勻,含水量高(約98%~99%),近似自由電泳,樣品擴散電流相對自由,對樣品的吸附最小,因此電泳圖譜清晰,分辨率高,重復性好。
(3)瓊脂糖透明,無紫外吸收,電泳過程和結果可用紫外燈直接檢測和定量。
(4)電泳後區帶易染色,樣品易洗脫,便於定量測定。制備幹膜可以長期保存。
目前,瓊脂糖常用作分離蛋白質和同工酶的電泳支持物。將瓊脂糖電泳與免疫化學相結合,發展了壹種免疫電泳技術,它可以識別用其他方法不能識別的復雜系統。由於超微技術的建立,可以檢測0.1ug的蛋白質。
瓊脂糖凝膠電泳也常用於分離和鑒定核酸,如DNA鑒定和DNA限制性內切酶作圖。該方法操作方便、設備簡單、樣本量小、分辨率高,已成為基因工程研究中常用的實驗方法之壹。瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離主要是基於它們的相對分子量和分子構型,也與凝膠的濃度密切相關。
1.核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關系
(1)DNA分子的大小在凝膠中,DNA片段的遷移距離(淌度)與堿基對的對數成反比,所以通過比較標準品和未知片段的遷移距離,可以測出未知片段的大小。而當DNA分子的大小超過20kb時,普通瓊脂糖凝膠很難將它們分離。此時電泳的遷移率不再取決於分子大小,所以瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時,分子大小不能超過這個值。
(2)瓊脂糖的濃度如下表所示,不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠電泳分離。
epi瓊脂糖濃度和DNA分離範圍
瓊脂糖濃度/% 0 . 30 . 60 . 7 0 . 9 1 . 21 . 52 . 0
線性DNA大小/KB60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1
2.核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系
不同構型DNA的移動速度順序為:共價閉合環狀DNA (CCCNA)>線性DNA & gt開環雙鏈環狀DNA。當瓊脂糖濃度過高時,環狀DNA(壹般為球形)無法進入凝膠,相對遷移率為0(Rm=0),而同樣大小的線性雙鏈DNA(剛性棒)可以在長軸方向前進(RM >: 0),可見這三種構型的相對遷移率主要取決於凝膠濃度,但同時也受電流強度和緩沖液離子強度的影響。
3.電泳方法
(1)凝膠類型
用於分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型和水平型(板式)。水平電泳是將凝膠板完全浸入1-2mm的電極緩沖液中,所以也叫浸沒式電泳。目前後者應用更廣泛,因為制作凝膠和加樣更方便,電泳槽簡單易做,可以根據需要制備不同規格的凝膠板以節省凝膠,所以更受歡迎。
(2)緩沖系統
在沒有離子的情況下,電流太小,DNA遷移慢;相反,離子強度高的緩沖液由於電流過大會產生大量的熱量,嚴重時會造成膠熔和DNA變性。
常用的電泳緩沖液有EDTA(pH8.0)、三醋酸(TAE)、三硼酸(TBE)或三磷酸(TPE)等。,濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液壹般制成濃縮原液,使用時稀釋至所需倍數。
TAE緩沖能力低,後兩者緩沖能力足夠高,所以更常用。濃縮的TBE溶液在長期儲存後會沈澱。為了避免這壹缺點,在室溫下儲存5×溶液,用0.5×工作液稀釋10倍,可以提供足夠的緩沖能力。
(3)凝膠的制備
以稀釋的電極緩沖溶液為溶劑,用沸水浴或微波爐制備壹定濃度的溶膠,倒入水平的塑料框或垂直的塑料薄膜中,插入梳子中,自然冷卻。
(4)樣品制備和樣品添加
將DNA樣品溶解在適量的Tris-EDTA緩沖液中,該緩沖液含有0.25%溴酚藍或其他指示染料、10%-15%蔗糖或5%-10%甘油,以增加其比重並濃縮樣品。為了避免蔗糖或甘油在電泳結果中可能產生U形帶的可能性,可以用2.5%的Ficoll(多糖)代替蔗糖或甘油。
(5)電泳
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA的實驗條件表明,在低濃度、低電壓下分離效果良好。在低電壓下,線性DNA分子的電泳遷移率與施加的電壓成正比。然而,當電場強度增加時,較大DNA片段的遷移率增加相對較少。因此,隨著電壓的增加,電泳分辨率會降低。為了通過電泳獲得DNA片段的最大分辨率,電場強度不應高於5V/cm。
電泳體系的溫度對DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著影響。電泳通常在室溫下進行,只有當凝膠濃度低於0.5%時,才能在4℃下進行電泳,以增加凝膠的硬度。
(6)染色和拍照
常用熒光染料溴化乙錠(EB)染色,在紫外光下觀察DNA條帶,用紫外分析儀拍照,或用凝膠成像系統輸出照片,分析相關數據。生物化學和分子生物學的研究往往需要電泳分離的DNA進行分子雜交,而瓊脂糖不適合雜交。1975年,Southren創造了壹種將DNA條帶原位轉移到硝酸纖維素膜(NC膜)上,然後雜交的方法,稱為Southren印跡法。隨後,Alwine等人使用了壹種類似的方法進行RNA印跡,稱為Northern印跡。Towbin等人在1979中設計了壹種將蛋白質從凝膠轉移到硝酸纖維素膜上的裝置,將蛋白質轉移到膜上,然後與相應的配體如抗體反應,稱為Western blotting。這種裝置制成了膜、凝膠、濾紙等。變成夾心餅幹,用低電壓大電流電泳完成轉移。在1982中,Reinhart等人用電轉移法將等電聚焦蛋白區帶從凝膠轉移到特定的膜上,稱為東方印跡。
目前,國內外已有多種用於核酸和蛋白質印跡轉移的電泳裝置,使得印跡轉移快速、高效、可重復,應用更加廣泛。聚丙烯酰胺凝膠也可用於印跡轉移電泳,但轉移蛋白質時,凝膠中不應含有SDS、尿素等變性劑。轉移電泳的支撐膜也有多種選擇。這幾年尼龍膜用的比較多,因為尼龍膜機械性能好,烤著不會變脆,使用起來比硝酸纖維素膜方便。
進行印跡轉移電泳時,要註意緩沖液的離子強度要低,pH要遠離pI,使蛋白質帶更多的電荷。壹般情況下,應使用穩定性更好的Tris緩沖系統。還要註意凝膠和支撐膜之間有氣泡。適當提高電壓或電流可以提高轉移速度,但也會增加熱效應,所以電壓或電流不宜過高。壹般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小於20kb的DNA。這是因為在瓊脂糖凝膠中,當DNA分子的有效直徑超過凝膠的孔徑時,在電場的作用下,DNA被迫變形並擠過孔隙,沿遊動方向拉直,所以分子大小對遷移率的影響不大。如果此時改變電場的方向,DNA分子必然會改變構象,沿著新的遊動方向伸直,而轉彎時間與DNA分子的大小密切相關。在1983中,Schwartz等人根據DNA分子的彈性弛豫時間(停留時間外推至0)與DNA分子大小有關的特性,設計了脈沖電場梯度凝膠,交替使用兩個垂直的不均勻電場,使DNA分子在凝膠中改變方向,從而根據分子大小分離DNA。後來Carle等人改進了電泳技術,發現電場的周期性反轉也可以通過電泳分離大分子DNA。電泳系統由水平電泳槽和兩組獨立且垂直的電極組成。壹組負極為N,正極為S;另壹組負電極為W,正電極為e .壹個正方形瓊脂糖凝膠板(10cm*10cm或20cm*20cm)以45度為圓心,電場在N-S和w-e之間交替建立,交變電場變化的時間與待分離的DNA分子大小有關。
在電泳過程中,DNA分子處於連續的交變電場中。先移動到s極,再換到e極。每次電場方向改變,DNA分子都會有壹定的時間松弛,改變形狀和遷移方向。只有當DNA分子達到某種構型時,才能繼續以前的時態。DNA分子的凈運動方向垂直於取樣線,使得樣品中的每壹種組分沿著同壹泳道形成自己的區域。交變脈沖電泳可以有效分離百萬堿基對的大分子DNA。較新儀器的電極之間的角度和脈沖時間可以調節,使用起來更方便。
此外,瓊脂糖平板經常用於各種免疫電泳結合免疫擴散技術。