關鍵詞:CCAAT，HAP復合物，轉錄因子，氧化還原系統
轉錄因子HAP的DNA結合活性受細胞氧化還原調節
姚全紅、顏、楊、劉、洪孟敏
中國科學院上海植物生理研究所，上海200032
摘要:啤酒酵母CCAAT結合因子是壹個異聚復合體，含有HAP2、HAP3、HAP4和HAP5亞單位。這種因子可以特異性地結合到許多酵母基因啟動子內含有CCAAT的上遊位點，然後激活轉錄。通過使用酵母單雜交系統，我們試圖從構建在大腸桿菌-酵母穿梭載體pPC86中的水稻cDNA-Gal4融合文庫中分離酵母HAP5基因的對應物。然而，我們發現了編碼谷氧還蛋白的cDNA(圖1)。結果表明酵母細胞的細胞氧化還原環境可能是調節HAP3亞基CCAAT盒結合活性的壹個因素(表1)。68和72位高度保守的半胱氨酸殘基已被轉化為絲氨酸的HAP3突變體的結果支持了上述建議(表2)。
關鍵詞:CCAAT，HAP復合物，轉錄因子，氧化還原系統
在真核基因轉錄開始時，壹些被稱為轉錄因子的核蛋白會與真核基因啟動子上遊的順式作用元件結合，以增強或抑制真核基因轉錄(Wolberger 1993)。有些轉錄因子要經過磷酸化或二聚化引起蛋白質分子構型的壹些變化，才具有與DNA結合的能力(Hunter和Karin 1992)。最近鄭等(1998)報道了壹些轉錄因子與DNA的結合活性受細胞內氧化還原狀態的調節。例如，當通過凝膠滯後試驗在體外研究Jun和Fos轉錄因子與含有Ap-1結合位點的DNA的結合時，觀察到硫氧還蛋白、還原型輔酶II (NADPH)和硫氧還蛋白還原酶可以顯著提高其異二聚體與DNA的結合能力(Abate等，1990)。
在某些真核基因的轉錄起始點上遊有壹個核心序列為CCAAT的順式元件，它可以是正反兩個方向(Van huisduijnen et al . 1987)。已知釀酒酵母中至少有16個基因在5’端上遊都含有CCAAT元件。HAP復合物(Pinkham和Keng 1992)是壹種反式作用因子，與這些基因上遊的CCAAT結合，調節基因轉錄。它是壹種由HAP2、HAP3、HAP4和HAP5四個蛋白亞單位組成的異質聚合物，其中HAP2和HAP3都含有DNA結合結構域，但它們都不具有DNA結合活性。只有和通過其亞基結合域形成二聚體蛋白，才能形成完整的CCAAT盒結合域(Xing等1993)。此外，體內和體外研究都證實，這種復雜功能域的形成需要HAP5亞單位的參與(McNabb等1995)。HAP4亞基含有激活域，起激活基因轉錄的作用(Foraburg和Guarente 1989)。近年來，編碼CCAT盒結合蛋白的基因已經從粟酒裂殖酵母、小鼠、大鼠和其他生物中克隆出來，並且這些CCAT結合蛋白和酵母HAP轉錄因子樣蛋白之間存在高度同源的結構域(Van Huijsduijnen等1990)；在高等植物中，也已經從油菜中克隆了與HAP2亞基中的DNA結構域具有高度同源性的基因(Albani和Robert 1995)。
我們曾報道釀酒酵母CYC1基因啟動子上遊含有CCAAT盒的DNA片段為“魚鉺”，用酵母單雜交方法從水稻cDNA-GAL4表達文庫中篩選出壹個編碼HAP2相似蛋白的cDNA克隆(姚待發表)。在本研究中，通過酵母單雜交方法在HAP5突變酵母細胞中從水稻cDNA-GAL4表達文庫中篩選編碼水稻HAP5樣蛋白的cDNA。但沒有篩選出HAP5的相似cDNA，而是對水稻中編碼谷胱甘肽的cDNA進行了多次篩選。這壹出乎意料的結果表明HAP轉錄因子與DNA的結合可能受氧化還原調節。本文報道了上述實驗結果和HAP3亞基半胱氨酸殘基的突變實驗，並討論了HAP轉錄因子的DNA結合活性是否受氧化還原調節。
1材料和方法
1.1工具酶及化學試劑限制性內切酶等基因工程工具酶為德國Boeringer公司產品，X-gal購自適馬公司，其他化學試劑為美國適馬公司或國產AR級試劑。
1.2菌株和質粒MC8是具有氨基酸缺陷(Thi-、Trp-、URA-、Leu-、HIS-)的大腸桿菌菌株。釀酒酵母Hap 5缺陷株)hap 5δhap 5-10(MATα，Leu 2-3，112，Ura3-52，HIS 4-519，Adel-100)。大腸桿菌-酵母穿梭載體PLG δ-265UP1含有lacZ報告基因、URA選擇標記、2μ復制序列和酵母CCAAT盒。LacZ報告基因由CYC1的基礎啟動子控制，含有CCAAT盒的DNA片段位於CYC1的基礎啟動子上遊。該元件與轉錄因子結合後，可以調控lacZ基因的表達。釀酒酵母-大腸桿菌穿梭載體pPC86攜帶色氨酸合成酶基因，由祝群博士提出。PDB20(HAP5)質粒具有LEU選擇標記，酵母HAP5基因的表達受ADH1啟動子控制，用作鑒定水稻樣HAP5 cDNA的陽性對照。PYP2質粒由本實驗室構建，含有PGK啟動子和色氨酸合成酶基因，用於表達的cDNA插入在PGK啟動子之後的BamH和Kpn切割位點之間。
1.3 PCR引物當酵母pPC86載體cDNA插入5’-末端Gal4激活域時，引物為gal 4(5’-ggatgtttatacact-3’)，3’-末端ADH終止子上的引物為tad 4(5’-ttgattggagaacttgacc-3’)。水稻谷胱甘肽氧化還原蛋白cDNA(Minakichi et al. 1994)兩側的引物是:5’-末端翻譯起始密碼子ATG附近的引物gluta 1(5’aaggatccatgcgcgccacaaggccaag 3’)，3’-末端翻譯終止密碼子標簽附近的引物gluta 2(5’ttgtggtacctagggatggtcggttgg)。釀酒酵母HAP3(Hahn et al . 1988)兩側的引物分別是:5’-端翻譯起始密碼子ATG附近的引物hap3z 1(5’aaggatcatacagagccc 3’)，3’-端翻譯終止密碼子TGA附近的引物hap3f 1(5’ttgtgattactaccacctcc)。用於釀酒酵母HAP3基因第68位Cys突變為Ser的內突變引物為:5’端引物hap3z 2(5’cgaaagagtcatgcaggag 3’)帶突變堿基，3’端引物hap3f 2(5’ctctgcatggatctttcg 3’)。用於將釀酒酵母HAP3基因第72位的Cys突變為Ser的內突變引物為:5’端引物hap3z 3(5’catgcaggagtctcgatg 3’)帶突變堿基，3’端引物hap3f 3(5’cactgacacagactcctgcatg 3’)。
1.4酵母表達的水稻cDNA文庫用酵母載體pPC86構建的水稻IR36幼苗的表達性cDNA文庫由美國索爾克研究所的祝群博士提供。
大腸桿菌MC8在1.5培養基中生長在添加了亮氨酸、尿嘧啶、組氨酸和維生素B1的M9基本培養基中，用於選擇具有水稻cDNA的pPC86質粒。根據Sherman(1991)的方法制備含有2%葡萄糖或2%乳酸的增菌培養基YPD、基礎培養基SC和酵母X-gal培養基。
1.6酵母感受態細胞的制備和質粒轉化選擇Gietz等(1992)的乙酸鋰方法用於釀酒酵母的質粒轉化。5 ml釀酒酵母在30℃培養過夜，直到OD600約為0.5，然後擴大至50ml。再生長4小時後，以5000×g離心8分鐘收集細胞。用20ml無菌水沖洗，但用10ml新配制的LiAc溶液100mmol/L(用Tris 10mmol/L和EDTA 0.1mmol/L緩沖液配制)沖洗1次。在7000×g離心8min後，酵母細胞最終懸浮在0.5ml LiAc溶液中。將1μg質粒DNA、50μg鮭魚精DNA和300μl含40% PEG3350的LiAc溶液加入50μl酵母懸液中，在30℃保溫30分鐘。然後在42℃熱激65438±05分鐘。將通過離心收集的酵母細胞重懸於TE溶液中，並塗布於酵母選擇培養基上。
1.7 DNA操作快速提取酵母DNA是按照Robzyk和Kassir(1992)的方法進行的。根據標準分子克隆程序(Sambrook等，1989)操作DNA。根據Dower等(1988)的方法進行電擊轉化大腸桿菌。提取含有水稻cDNA陽性質粒的雙鏈DNA，在ABI 377 DNA自動測序儀上測序。引物GAL4和TAD4的PCR擴增反應條件為:94℃ 40s，42℃ 50s，72℃ 3min，30輪* * *擴增。水稻谷胱甘肽氧化還原蛋白cDNA兩側的引物Gluta1和Gluta2的PCR擴增反應條件為:94℃30s，66℃45s，72℃30s，* * * 30循環。酵母中HAP3基因的定點突變采用重疊延伸法(Ho et al. 1989)。HAP3外引物間及外引物與內引物間突變的PCR擴增反應條件為:94℃30s，48℃40s，72℃30s，* * * 30循環。
2個結果
2.1酵母單雜交法篩選水稻中與酵母HAP5基因相似的cDNA
酵母單雜交系統最初是由王和Reed (1993)設計的，它包含兩個質粒:壹個是酵母表達質粒，用於表達cDNA和GAL4激活域的融合蛋白；另壹種質粒將順式作用元件與帶有堿性啟動子的細菌lacZ報告基因連接起來。這個載體被稱為誘餌質粒。本實驗中酵母單雜交系統使用的誘餌質粒為PLG δ-265UP1，是在178載體中CYC1基礎啟動子上遊插入含有CCAAT的順式作用元件構建而成。首先，我們將誘餌質粒PLG δ-265UP1轉化到酵母菌株δ hap 5-10中，在不含尿嘧啶的平板上獲得了轉化子δhap 5-10(PLGδ-265 up 1)。然後將30μg含水稻cDNA的pPC86載體轉化到感受態酵母中，在不含尿嘧啶和色氨酸的培養基上培養。獲得約3×106個轉化子，將這些轉化子復制到有硝酸纖維素膜的X-gal平板上進行顯色反應。作為陽性對照，含有HAP5基因表達載體pDB20(HAP5)和誘餌質粒PLGδ-265 up 1的δhap 5-10酵母菌株在培養6小時後變成藍色。而含有水稻cDNA文庫的質粒pPC86的酵母菌株δhap 5-10(PLGδ-265 up 1)在2天後出現藍色菌落。該實驗重復4次，壹個* * *，獲得45個藍色酵母菌菌落。
2.2酵母陽性菌落的重復篩選
為了驗證初篩得到的酵母陽性菌落中是否含有與HAP5功能相似的cDNA克隆，從上述45個酵母陽性菌落中提取DNA，電擊轉化大腸桿菌MC8，在2YT+Ap平板上培養，然後復制到不含色氨酸的M9培養基平板上培養。因為pPC86質粒攜帶編碼TRP合酶的標記基因，所以能生長的菌落表明它攜帶pPC86質粒。然後，從能在不含色氨酸的M9培養基上生長的大腸桿菌中提取質粒DNA，並將這些質粒DNA轉化到酵母δhap 5-10(PLGδ-265 up 1)菌株中，然後在X-gal平板上顯色，從中鑒定出能使酵母菌落變藍的17個cDNA克隆。
2.3陽性克隆的鑒定和測序
由於hap5缺陷型酵母不能在含有不可發酵碳源的培養基上生長，我們將經過四次酵母單雜交篩選後剩下的17陽性質粒轉化到δ HAP 5-10缺陷型酵母中進行功能互補鑒定。結果表明，這些含有水稻cDNA的陽性質粒都不能使hap5缺陷型酵母在不可發酵碳源培養基上生長。它們都不具有補償缺陷酵母中缺失的HAP5的功能，因此它們不是編碼HAP5的cDNA克隆。為了理解它們的結構，我們使用GAL4和TAD4作為PCR擴增的引物。擴增的cDNA序列分別用Sau3A酶消化，每批篩選的cDNA按酶消化的帶型分類。結果表明，在17條篩選出的陽性cDNA中，有6條具有相似的酶帶。這種cDNA克隆在四個篩選文庫中獲得了三次。我們使用GAL4和TAD4引物直接分析具有相似酶帶型的cDNA的DNA序列，編號為C3。圖1的結果顯示其核苷酸序列與已報道的水稻谷胱甘肽氧化還原蛋白cDNA (Minakichi et al. 1994)完全相同。我們還根據水稻谷胱甘肽氧化還原蛋白cDNA的核苷酸序列，在cDNA兩端合成了寡核苷酸引物gluta1和gluta2，通過PCR擴增出6個具有相同酶帶模式的cDNA克隆。結果還證實它們都是編碼水稻谷胱甘肽氧化還原蛋白的cDNA。
圖1水稻C3 cDNA克隆的核苷酸序列和推導的氨基酸序列。
圖1 C3 cDNA克隆的序列和預測的氨基酸序列
2.4 C3編碼的谷胱甘肽氧化還原酶對羥基磷灰石復合物DNA結合活性的影響
以C3的DNA為模板，以兩端帶有BamH和Kpn酶切位點的gluta1和gluta2為引物進行PCR擴增。將含有谷氧還蛋白基因完整編碼區的PCR擴增片段用BamHⅰⅰ和Kpnⅰⅰ消化，克隆到酵母表達載體pYP2中PGK啟動子後相應的限制性位點，形成酵母重組質粒pYP3。然後將pYP2、pDB20、pDB20(HAP5)和pYP3四種質粒分別轉化到兩個酵母菌株δhap 5-10(p 178)和δhap 5-1中。將上述四個質粒分別轉化到兩個酵母菌株中。這兩個酵母菌株都是hap5突變體，但它們含有具有激活功能的HAP4蛋白和具有結合功能的HAP2和HAP3蛋白。在不含尿嘧啶和色氨酸的培養基上獲得轉化體，將8個酵母轉化體復制到具有硝酸纖維素膜的X-gal平板上進行顯色反應。2天後，轉化體δhap 5-10(PYP 3+PLGδ-265 up 1)顯示藍色。陽性對照菌株δhap 5-10(PDB 20(hap 5)+PLGδ-265 up 1)菌落為深藍色。在酵母菌株δhap 5-10中發現陰性對照菌株δhap 5-10(PYP 2+PLGδ-265 up 1)和δhap 5-10(PDB 20+PLGδ-265 up 1)及4個質粒。結果表明，谷氧還蛋白能使HAP2、HAP3和HAP4在沒有HAP5的情況下表達lacZ基因。
表1 C3編碼的谷氧還蛋白對誘餌質粒上lacZ基因表達的影響
表1 C3編碼的谷氧還蛋白對誘餌質粒中lacZ基因表達的影響
lacZ基因的質粒表達
p 178 PLGδ-265 up 1
pYP2 - -
pDB20 - -
pDB20(HAP5) - ++
pYP3 - +
2.5 HAP 3蛋白Cys位點突變對HAP復合物DNA結合活性的影響
在hap5缺陷的酵母細胞中，谷氧還蛋白可以使HAP2、HAP3和HAP4壹起表達lacZ。由於已知谷氧還蛋白是參與調節細胞氧化還原狀態的主要成分，我們推測其對HAP蛋白的作用可能是調節HAP蛋白中-SH和-S-S之間的可逆反應。為了搞清楚它是否起這個作用，我們把HAP3基因第68位和第72位的Cys突變成Ser，驗證這個猜想是否正確。方法以菌株δhap 5-10的DNA為模板，用兩對引物HAP3Z1、HAP3Z2和HAP3F1進行PCR擴增。然後，使用兩個回收的PCR產物作為模板，通過引物HAP3Z1和HAP3F1擴增第68位Cys突變為Ser的HAP3基因。通過相同的方法獲得從72位的Cys突變為Ser的HAP3基因。將HAP3基因和兩個突變基因的BamHⅰⅰ和Kpnⅰⅰ產物分別克隆到pYP2酵母表達載體中，形成含HAP3基因的質粒pYP4、含第68個Cys突變為Ser的HAP3基因的質粒pYP5和含第72個Cys突變為Ser的HAP3基因的質粒pYP6。然後，將pYP4、pYP5和pYP6質粒分別轉化到含有質粒p178和PLGδ-265 up 1的酵母δhap 5-10菌株中，在不含尿嘧啶和色氨酸的培養基上選擇酵母轉化體。將轉化體復制到帶有硝酸纖維素膜的X-gal平板上進行顯色反應。2天後，在不存在谷氧還蛋白的情況下，具有HAP3突變基因的兩個質粒的轉化體顯示藍色。然而，具有正常HAP3基因質粒的轉化子不顯示藍色，並且轉化到δhap 5-10(178)菌株中的四個轉化子不顯示藍色(表2)。結果表明，在hap5基因突變的酵母細胞中，突變的HAP3亞基-SH和細胞中的HAP2和HAP4能使lacZ基因組在無谷氧還蛋白氧還原調節的單雜交系統中有性表達。
HAP 3蛋白Cys突變對誘餌質粒上lacZ基因表達的影響
表2半胱氨酸殘基突變HAP3對誘餌質粒中lacZ基因表達的影響
lacZ基因的質粒表達
p 178 PLGδ-265 up 1
pYP2 - -
pYP4 - -
pYP5 - +
pYP6 - +
3討論
細胞內調節氧化還原狀態的系統有很多，其中壹種是谷胱甘肽氧化還原系統，包括谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽氧化還原蛋白(Holmgren 1989)。該系統通過將谷胱甘肽氧化還原蛋白中半胱氨酸殘基上的-SH氧化成-S-S-鍵或可逆還原成-SH來調節細胞中的氧化還原狀態。這種氧化還原狀態還促進某些功能蛋白質分子上的-SH或-S-S-的可逆氧化或還原，引起蛋白質分子的結構變化，從而影響蛋白質分子的活性、穩定性和正確折疊等重要功能(Holmgren 1989)。
在HAP2酵母突變細胞中，通過酵母單雜交方法，從水稻cDNA-GAL4表達文庫中成功篩選出與水稻HAP2相似的基因RAPB，RAPB基因可以補充酵母的hap2缺陷。這表明用這種單雜交系統篩選轉錄因子基因是有效的。按道理，同壹個酵母單雜交系統也應該能在酵母hap5突變體的細胞中篩選出水稻HAP5的相似基因，但得到的陽性cDNA克隆不能補充酵母HAP5的缺陷特征。陽性cDNA克隆的核苷酸序列分析結果表明，從水稻cDNA文庫獲得的cDNA編碼谷胱甘肽氧化還原蛋白，而不是預期的水稻編碼酵母樣HAP5蛋白。Minakichi等人(1994)報道，谷氧還蛋白基因在水稻中的表達主要集中在種子中，而在葉片中的表達量很低。在四次篩選水稻葉片表達文庫的過程中，對谷氧還蛋白基因進行了三次篩選，說明這個實驗結果不是偶然的。至於為什麽沒有篩選到HAP5的相似基因，是因為我們使用的水稻cDNA-GAL4表達文庫中沒有HAP5-cDNA，還是因為水稻中沒有功能相似的基因，這需要進壹步研究。
酵母功能互補試驗表明，水稻中的谷氧還蛋白基因與HAP5基因沒有明顯的互補活性。酵母單雜交試驗結果也表明，谷氧還蛋白基因增強水稻lacZ基因表達的活性遠低於HAP5基因。據推測，酵母HAP5蛋白的功能可能是與HAP2和HAP3亞基的疏水相互作用，從而促進形成穩定的復合結構，可以結合CCAAT盒(McNabb等1995)。如果這個推測是正確的，那麽谷氧還蛋白的功能也可能是將HAP3亞基保持在-SH基團狀態，從而與CCAAT盒形成弱結合的HAP2和HAP3之間的不穩定復合結構。谷氧還蛋白促進HAP復合物的DNA結合活性，HAP3亞基中的半胱氨酸殘基突變為絲氨酸殘基的實驗結果與上述推測非常壹致。也就是說，HAP3蛋白與68位和72位Cys突變為Ser的HAP2蛋白之間的相互作用意味著它具有CCAAT盒結合活性。
到目前為止，已經報道了許多轉錄因子，如c-fos和c-jun(Abate等人1990)、NFκB/Rel(Matthews等人1992)、c-Myb(Guehmann等人1992)和BPV-1。USF(Pognonec等人1992)和NF-Y(Nakshatri等人1996)的DNA結合活性都受氧化還原調節。其中，NF-Y是從人和小鼠細胞中克隆的轉錄因子，能與CCAAT盒結合，也是壹種異多聚體蛋白。NF-YA和NF-YB分別是釀酒酵母中HAP2和HAP3的相似基因，它們具有高度同源的結構域，並且功能可互換(Maity等1992，Kim等1996，Coustry等1995)。此外，迄今為止發表的類蛋白中三個半胱氨酸殘基的位置是保守的(Xing et al. 1993)。
Nakshatri等(1996)報道小鼠NF-Y轉錄因子與CCAAT盒體外結合活性受氧化還原狀態調節。硫氧還蛋白能增強NF-Y異聚蛋白與CCAT盒的結合活性，當-SH基團被烷基化時，NF-Y與CCAT的結合活性被破壞。通過逐個突變去除蛋白質分子的半胱氨酸殘基，證明NF-YB亞基中第85位和第89位的兩個半胱氨酸受到調控。硫氧還蛋白和谷胱甘肽氧化還原蛋白壹樣，也是細胞內的氧化還原調節系統。因此，我們報道了谷氧還蛋白可以在沒有HAP5的情況下將HAP2和HAP3結合到CCAAT盒的發現。他們的結果，尤其是硫氧還蛋白對NF-Y蛋白與CCAAT盒結合活性的調節可以相互印證，對進壹步了解HAP5(NF-YC)亞基的功能具有重要意義。
國家自然科學基金(39893320)資助的課題。
作者:中國科學院上海植物生理研究所，上海200032。