臨床上疑似白喉的病人不必等待檢驗結果，應立即給予抗毒素和抗生素治療。但對於白喉流行期的首例病人應做微生物學檢驗予以證實。
直接染色鏡檢
用棉拭采取假膜邊緣部滲出物，塗片，用奈瑟氏染色或美蘭染色，鏡檢有無含異染顆粒的棒狀桿菌。結合臨床癥狀，可作出初步診斷。確診必須通過細菌培養並進行毒力試驗。
凝固血清棉拭培養法
將沾有馬或牛血清的棉拭子放在無菌試管內，經8～10磅蒸氣滅菌20～30分鐘，並使血清凝固，且此凝固血清棉拭采取病人咽部標本，置37℃培養8～10小時後，直接塗片鏡檢。此法可作為大量檢查時快速培養診斷之用。
培養檢查
將棉試檢材接種於雞蛋斜面或Loeffer''''s血清凝固斜面培養基及亞碲酸鉀平板培養基上，置37℃培養，待斜面或平板上長出典型的灰色疑菌落，挑取轉種到雞蛋呀或血清斜面進行分離培養，以供進壹步形態染色或毒力試驗鑒定。
毒力試驗
1．豚鼠試驗 取體重250g 豚鼠2只，其中壹只試驗前12小時，由腹腔註射白喉抗毒素250～500單位，供做對照。然後對照。然後各於皮下註射48小時的培養液2ml，若於2～4天註射抗毒素的豚鼠死亡，而對照豚鼠存活，便證明所試驗菌株為有毒白喉桿菌。
2．體外試驗
①瓊脂平板獨立試驗 又稱E平板試驗，將浸有白喉抗毒素的無菌濾紙條貼在含20%馬血清的瓊脂平板上，然後沿濾紙條垂直方向劃線接種待測細菌，同時也接種已知產毒株和不產毒株做為對照。37℃培養48小時後，若待檢菌株產生白喉外毒素，則在濾紙條和劃線生長的菌苔交界外出現白色沈澱線。
②對流免疫電泳：將已知白喉抗毒素與待檢菌培養液分置瓊脂板兩孔中，通電1~2小時。若兩孔間出現白色沈澱線，表明待檢菌能產生白喉毒素，常用於大樣本量的檢測。
③SPA協同凝集試驗 將白喉抗毒素（IgG）預先吸附於金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA）上，再加入待檢菌培養物上清液。若有白喉毒素存在，即可與SPA-IgG結合，出現可見的凝集反應。此法更為簡便，快速 。