(1)酵母雙雜交控制的設置常規酵母雙雜交操作中壹般設置三種控制，即陽性控制、陰性控制和顯色系統控制。以紅娘GAL4酵母雙雜交篩選系統為例:
陽性對照:pGADT7-T+pGBKT7-53，其中T蛋白和53蛋白是已證實在酵母細胞中結合並啟動報告基因表達的兩種蛋白。
陰性對照:pGADT7-T+pGBKT7-lam，其中已證實T蛋白和lam蛋白在酵母細胞中不能結合。系統顏色控制，pGADT7-Pcl1，表達質粒可轉化酵母細胞引起？-半乳糖苷酶和？-半乳糖苷酶分泌，從而檢測顯色系統是否有問題。
(2)假陽性現象可能造成假陽性結果的原因有很多。常見的有三種:
被篩選的文庫蛋白本身具有轉錄活性，可以啟動報告基因的表達——在這種情況下，需要驗證被篩選的候選蛋白的自激活性。
酵母細胞可能同時含有壹個以上的文庫蛋白，其中壹個文庫蛋白可以與誘餌蛋白相互作用並結合。
這種情況下，陽性克隆需要再刮2~3次，以保證每個酵母克隆只含有壹個文庫蛋白和誘餌蛋白；另外，筆畫數不能太多，否則蛋白質表達質粒會丟失。其他未知原因引起的假陽性——這種情況需要重新* *將篩選出的候選文庫質粒和表達誘餌蛋白的質粒轉入酵母細胞或通過酵母雜交重新驗證。如果需要，可以將pGADT7-cDNA質粒和pGBKT7-bait質粒的載體進行轉換，以構建pGADT7-bait和pGBKT7-cDNA，並在酵母細胞中重新驗證。真正的陽性結合，也可以在酵母細胞中轉換後產生陽性結果。
(3)參照方案的常見問題和轉化效率低——盡量使用新鮮培養基和直徑約2~3 mm的新鮮酵母克隆，以保證酵母的活力；用於轉化的質粒可以在使用前用乙醇沈澱，以提高質粒的純度和濃度。
雜交效率低——可能是由於表達的融合蛋白對酵母細胞的毒性，在某些情況下，在液體培養基中生長不良的酵母，在換成瓊脂糖固體培養板時會生長得更好，這種情況可以用* * *轉化法進行檢驗；或將單旋酵母克隆分別鋪於5個10 mm培養板上，待克隆長出後，將所有克隆刮於5 mL 0.5×YPDA中。重新懸浮後，按照常規雜交操作步驟進行操作。背景過高——使用HIS3作為報告基因時，壹定程度上由於HIS3基因的泄露表達，背景可能過高。此時可使用適量的3-AT(3-氨基-1，2，4-三氮唑)降低背景；或者增加更嚴格的報告基因篩選如Ade。
誘餌蛋白具有自激活現象——壹個產生自激活的氨基酸序列可以通過克隆突變的方法敲除或突變，但這種方法可能會破壞兩種蛋白之間的相互作用。