1.材料和試劑
(1)PH8.6，0.1M巴比妥-巴比妥鈉緩沖液。
巴比妥鈉10.3克
巴比妥酸鹽1.84克
硫柳汞100毫克(防腐劑)
蒸餾水加熱溶解，定容至500毫升。
(2)1%預混合瓊脂(或瓊脂糖)
將1g瓊脂(或瓊脂糖)和100ml蒸餾水溶解。
(3)1%瓊脂糖凝膠
將1g瓊脂糖和50ml蒸餾水在波爐中煮沸或加熱溶解於水中(註意不要溢出並加入蒸發水)，然後加入50ml巴比妥緩沖液並混合均勻，4℃保存備用。
(4)抗原和相應的免疫血清。
2.設備和器材
玻璃板、模具、打孔針、滴管、帶蓋搪瓷盒(內有濕濾紙)、培養箱(25℃)、三角燒杯、玻璃攪拌器、微量取樣器等常用設備。
四個操作步驟:
1.預復合瓊脂玻璃平板的制備
用滴管將溶解的1%預配瓊脂加入到玻璃平板中，蓋住表面，放入培養箱中幹燥(或自然幹燥)制成凝膠平板。
2.凝膠板的制備
將瓊脂糖溶解，將溶解的瓊脂糖倒在水平臺上預先配制好的瓊脂玻璃板上，制成厚度約3 ~ 4 mm的瓊脂糖凝膠板，冷卻後按所需形狀打孔(註意不要在室溫下放置太久，盡量縮短操作時間，避免幹燥)。
梅花型:
3.免疫擴散及結果觀察
將抗原加入中心孔，將稀釋後的免疫血清加入周圍孔，留1孔加雙蒸水作為空白對照(註意:加樣至孔滿，不要溢出)。孔內液體滲入凝膠後，可放入恒溫箱中(必要時可反復加樣，第壹次加樣後孔內液體尚未完全擴散時應控制取樣間隔，以免在孔周圍形成不透明的白圈)。濕箱25℃放置24 ~ 48h，觀察抗原抗體產生的白色沈澱線。
免疫血清的效價用壹定抗原濃度下白色沈澱線的最高稀釋度表示。
如果不知道抗原濃度是否與免疫血清相當，也可以將抗原稀釋多倍，多做幾個梅花孔進行對比。
4.標本保存
為了保存標本，可以對其進行染色，步驟如下:
(1)將待保存的玻璃板用生理鹽水浸泡2 ~ 3天，每天換水1 ~ 2次，洗掉多余的抗原、抗體等蛋白質。
(2)浸泡洗滌後的玻璃平板的凝膠中加入5%甘油或0.5%瓊脂防止開裂，用濕的優質濾紙覆蓋凝膠(兩者之間無空氣)，通過37℃的液體後讓其徹底幹燥。
(3)將濾紙弄濕，輕輕取下，清洗橡膠表面。
(4)用0.05%氨基黑(混有5%醋酸)染色65438±00min，然後用5%醋酸脫色至背景無色，幹燥保存。也可用0.1 ~ 0.5%考馬斯亮藍(用10 ~ 20%醋酸配制)染色5 ~ 15 min，再用10 ~ 20%醋酸脫色至背景無色，幹燥保存。