幾乎所有的蝙蝠都是白天休息，晚上出去覓食。這種習性便於它們侵襲入睡的獵物，而自己不受其他動物或高溫陽光的傷害。蝙蝠通常喜歡棲息於孤立的地方，如山洞、縫隙、地洞或建築物內，也有棲於樹上、巖石上的。它們總是倒掛著休息。它們壹般聚成群體，從幾十只到幾十萬只。具有回聲定位能力的蝙蝠，能產生短促而頻率高的聲脈沖，這些聲波遇到附近物體便反射回來。蝙蝠聽到反射回來的回聲，能夠確定獵物及障礙物的位置和大小。這種本領要求蝙蝠將它們高度靈敏的耳、發聲中樞與其聽覺中樞緊密結合，蝙蝠個體之間也可能用聲脈沖的方式交流，當讓，有少部分蝙蝠依靠嗅覺和視覺找尋食物。
壹些種類的蝙蝠可以算是飛行高手，它們能夠在狹窄的地方非常敏捷地轉身，蝙蝠是惟壹能振翅飛翔的哺乳動物，其他像鼯鼠等能飛行的哺乳動物，只是靠翼形皮膜在空中滑行！夜間，蝙蝠靠聲波探路和捕食。它們發出人類聽不見的聲波。當這聲波遇到物體時，會像回聲壹樣返回來，由此蝙蝠就能辨別出這個物體是移動的還是靜止的，以及離它有多遠。長耳蝙蝠在飛行中捕食昆蟲，能將昆蟲從葉子上抓下來，因為它們的大耳朵使它能接受回聲。
蝙蝠雖然沒有大鳥那樣的羽毛和翅膀，飛行本領也不比大鳥，但其前肢十分發達，上臂、前臂、掌骨、指骨都特別長，並由它們支撐起壹層薄而多毛的，從指骨末端至肱骨、體側、後肢及尾巴之間的柔軟而堅韌的皮膜，形成蝙蝠獨特的飛行器官——翼手。蝙蝠的胸肌十分發達，胸骨具有龍骨突起，鎖骨也很發達，這些均與其特殊的運動方式有關。蝙蝠善於在夜間飛行，但在飛行之前需要借助滑翔，倘若跌落地面，就很難再飛起，飛行時把後腿向後伸，起著平衡的作用。
蝙蝠以冬眠的方式過冬，通常情況下，蝙蝠進入冬眠狀態後，新陳代謝降低，心跳和呼吸減慢，體溫降低到與環境溫度相壹致，但冬眠不深，在冬眠期有時還會排泄和進食，驚醒後能立即恢復正常。它們的繁殖力不高，而且有“延遲受精”的現象，即冬眠前交配時並不發生受精。雄性蝙蝠的精子會在雌性蝙蝠的生殖道裏度過寒冬，待蝙蝠醒眠後，經交配的雌蝙蝠才開始排卵和受精，然後懷孕、產仔。
蝙蝠在飛行時，可以利用超聲波判斷前方是否有障礙物。從前很多人說蝙蝠視力差，其實是壹個天大的誤區。最近已經有不少科學家指出，蝙蝠視力不差，不同種類的蝙蝠視力各有不同，蝙蝠使用超聲波，與它們的視力沒有必然聯系。蝙蝠是哺乳類中古老而十分特化的壹支，因前肢特化為翼而得名，分布於除南北兩極和某些海洋島嶼之外的全球各地，以熱帶、亞熱帶的種類和數量最多。由於蝙蝠其貌不揚的外表，加之屬於夜行動物，總讓人感到可怕。