有兩種組織分離方法。壹種是利用子實體組織，通過無菌操作從中間塊組織上取壹大塊綠豆肉，移植到PDA培養基斜面試管中或培養皿的培養基上。直徑9厘米的培養皿中可放3 ~ 5片。放置時，菇肉要靠近培養基，也可以半埋在培養基中，就像把種子播在土裏壹樣，以利於其發芽。猴頭菇肉組織塊將在25℃黑暗條件下培養約10天，在試管或培養皿中形成白色星形菌落。我們可以選擇強壯且無雜質的菌落，並轉移它們以獲得母種。另壹種是用菌木組織，菌木組織是生長猴頭菇子實體的壹塊木頭。也是壹種無菌操作方法。切取內部木塊，置於PDA培養基上，25℃培養。壹般3 ~ 4天在木塊上產生白色菌絲。小木塊上菌絲基本壹致的地方，可以認為是猴頭菌絲。如果有黃色、綠色、灰色或黑色，就是雜菌。壹旦發現，就會及時消除。選擇旋轉管培養的白色星形猴頭菇菌株作為母種。