酵母雙雜交系統利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白－蛋白的相互作用。主要有二類載體: a 含DNA -binding domain的載體; b 含DNA-activating domain的載體。上述二類載體在構建融合基因時， 測試蛋白基因與結構域基因必須在閱讀框內融合。融合基因在報告株中表達，其表達產物只有定位於核內才能驅動報告基因的轉錄。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad沒有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端應克隆來自SV40的T-抗原的壹段序列作為核定位的序列。