使用MH瓊脂，按產品說明書配制，pH為pH7.2~7.4。淋球菌以GC瓊脂為基礎，添加1%添加劑；其他鏈球菌使用含5%(V/V)羊血的MH瓊脂(檢測磺胺類藥物時，使用溶解的馬血)。
2.含藥瓊脂平板的制備
根據實驗設計，將不同濃度的稀釋抗菌藥物加入到已在45~50℃水浴中加熱溶解平衡的MH瓊脂中，充分混合後倒入滅菌平板中，瓊脂厚度為3 ~ 4 mm，通常按照1: 9的比例配制藥物瓊脂平板，根據需要選擇藥物濃度範圍。配制好的含藥瓊脂平板應裝入密封塑料袋中，在2~8℃冰箱中保存5天。
3.接種物的制備和接種
配制濃度相當於0.5麥克斯韋標準濁度計的菌懸液，然後用1∶10稀釋。用多點接種器吸取配制好的菌液(約1~2μl)接種於瓊脂平板表面。每點細菌數約為104CFU，形成直徑5 ~ 8 mm的空斑，接種後於35℃孵育16~20h(耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬古黴素腸球菌孵育時間應在24h以上)，觀察結果。奈瑟氏球菌和鏈球菌的細菌與5%二氧化碳和幽門螺桿菌在微需氧環境中孵育。
4.結果的判斷
將平板置於黑暗、無反射的物體表面，判斷試驗結束，抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。在含甲氧芐啶或磺胺的瓊脂平板上可見輕微細菌生長，與生長對照相比抑制細菌生長80%以上的最低藥物濃度作為終濃度。
如果在藥物濃度高於終末水平的瓊脂平板上，或在藥物濃度低但藥物濃度高的瓊脂平板上生長有兩個以上的菌落，應檢查培養物的純度或重復試驗。