壹、植物再生的意義植物生物技術以植物組織培養為主要手段，包括五個分支，即利用離體技術改良植物品種、經濟植物快速繁殖、種質超低溫保存、植物細胞大量培養和植物基因工程。藥用植物的離體培養，除了大量的植物細胞外，其余都涉及到再生植株的培養。與普通植物不同，在培養藥用植物再生植株時，需要註意藥用成分的變化。
(1)快速繁殖
通過離體大量培養再生植株達到快速繁殖的目的，主要用於:(1)自然繁殖率低的植株；(2)性狀不壹致的雜合植物，(3)資源稀缺的瀕危植物；(4)新培育的優良品種；(5)發芽優良品種和性狀優良的首選單株；(6)少量從國外引進的植物材料；(7)育種過程中需要快速擴繁的壹些自交系、原始材料和雜交後代；(8)通過組織培養或自然條件獲得的三倍體和多倍體植物；(9)清除致病菌(真菌、細菌和病毒)的植物。快繁技術能否應用取決於:(1)培養技術簡單、穩定、完善；(2)成本低於常規方法；(3)具備壹定的設備條件和技術實力；(4)市場需要且價格合適。如羅漢果、金釵石斛。
(2)無病毒植物
通過莖尖培養，或通過花瓣培養和愈傷組織長期培養，可獲得去除主要病毒的無病毒植株，將其作為母本進行大田生產，可獲得大量無病毒苗，可提高產量和品質，防止品種退化。如地黃、菊花等。
(3)種質保存
在4℃的低溫或液氮中，植物組織和細胞的生活力可以維持很長時間。可用於超低溫保存的植物材料有:(1)莖尖和側分生組織；(2)培養的植物細胞和胚狀體；(3)原生質體；(4)植物器官，如胚、胚乳、子房、花藥、花粉和種子。冷凍植物材料可以節省人力、土壤和物力。便於區域和國際種質交流，通過離體繁殖提供育種原料和脫毒苗。
(4)品種改良
利用離體技術改良植物品種的方法主要有:(1)通過培養花藥、花粉、未受精子房和胚珠獲得單倍體植株，進行單倍體育種；(2)通過胚乳培養獲得三倍體植株，或在植物組織培養中通過秋水仙堿或其他因子獲得多倍體植株；(3)通過體細胞克隆變異和細胞突變體篩選，獲得性狀優良的變異體和突變體；(4)原生質體培養和細胞雜交。無論采用什麽育種技術，都需要對植株進行誘導再生，並對其後代進行鑒定。如人參、枸杞等。
(5)植物基因工程
植物基因工程包括基因分離、載體系統和受體系統。它直接以控制性狀遺傳的基因為操作對象，可以更準確地改良品種。目前，已經分離和克隆了20多種基因。載體系統主要研究銅綠假單胞菌的Ti質粒系統(農桿菌T-DNA)。作為受體系統，可以使用原生質體、懸浮培養的細胞、來自愈傷組織或完整植物的體外植物器官。無論使用何種受體系統，轉化細胞都必須再生為完整的植株，而植株再生是植物基因工程中的壹個主要環節。如龍葵和菘藍。
二、植物再生的基本原理
生物界普遍存在再生現象，生物再生是自然選擇和人工選擇的結果。壹般低等生物再生能力強，神經系統更發達的高等動物再生能力較弱。在植物中，細胞、組織和器官可以在體外生長發育，形成完整的植物。然而，不同種類的植物，或同壹植物的不同品種，甚至同壹植物的不同組織和器官的細胞具有不同的再生能力。壹般野生植物比栽培植物再生能力強，無性植物比種子繁殖植物強。
植物再生的基礎在於細胞的遺傳全能性，即每個細胞都包含了產生壹個完整生物體的全部遺傳信息。在適當的條件下，壹個具有全能性的活細胞的發育和分化受其DNA上某些基因的激活或抑制控制，壹個細胞可以形成壹個全新的生物體。植物離體再生是細胞離體培養在各種環境因素的刺激和作用下，脫分化和再分化的結果。可能是因為植物細胞的分化只是相對穩定的。在離體培養中，特化細胞更容易通過去分化恢復全能性，全能性去分化細胞再分化產生完整的小植株。分化是植物再生的中心問題，它與許多因素有關。植物激素是化學信使。作為基因表達的“效應器”，它們對RNA和蛋白質的合成有直接影響，並在細胞去分化和再分化過程中發揮重要的有時是決定性的作用。
雖然很多問題還很不清楚，但目前認為植物再生的基本原理是:(1)植物細胞的全能性；(2)植物細胞的脫分化和再分化；(3)植物激素的平衡。這些基本原則既是組織培養的壹般指導原則，也是有待進壹步研究的壹些基本理論課題。
三、植物再生的基本途徑
離體培養再生植株的形態發生有兩種基本方式，即器官發生和胚胎發生。
這兩種形態發生中的壹些經歷愈傷組織階段，而另壹些則直接在離體的母體組織中產生。
器官發生
器官發生的方式是通過器官分化形成完整的植株，如貝母、藏紅花、白子菜、蘆薈等。離體培養的器官分化包括不定芽、不定根、鱗莖、球莖、塊莖、原球莖和花的形成。不定芽和不定根形成再生植株的途徑有三種:(1)先形成芽，然後在芽上產生根；(2)先形成根，然後在根上產生芽；(3)愈傷組織上同時產生芽和根，然後在芽和根之間形成維管系統，連接成統壹的軸狀結構。大多數情況下，是第壹種方式。還有通過鱗莖、球莖、塊莖、原球莖等器官分化的不同情況。
在植物組織培養中，雖然通過器官發生進行植物再生的報道很多，但是關於基礎研究的信息還是很少。大多數研究繼續集中於外植體、培養基和環境條件調節的經驗操作。大多數情況下，人們只能觀察到已經表現出來的分化狀態，而很難追蹤到分化的過程。與形態發生的起源和方向相關的因素目前還不清楚。在這些因素中，有離體培養體系中各種物質的變化和相互作用，這些物質來源於培養過程中的培養基、外植體及其代謝產物。
體外培養，只有少數細胞被激活，而且啟動是異步的。Torrey(1966)提出了分生組織假說，形態發生始於愈傷組織中形成的分生組織團，即分生組織。在培養體系中各種因素的作用下，分生組織產生不同的原基，這些原基或形成根、芽，或因因素的不同性質而發育成胚狀體。分生組織可能發生在組織和培養基的界面上，其形成部位可能由從培養基向組織擴散的物質引起的生理梯度決定。
Skoog和Miller提出了激素平衡假說，認為器官分化與細胞分裂素和生長素的比例有關。在大多數情況下，生長素與細胞分裂素的高比例有利於根的形成，反之則有利於芽的形成。由於內源激素的存在和外植體抑制物質的積累，出現了許多相反的情況。在這壹原理的實際應用中，有時需要添加或省略某種植物激素，要考慮以下因素:(1)植物激素的種類和組合；(2)植物激素的絕對濃度；(3)植物激素，主要是細胞分裂素與生長素的比例；(4)植物激素的順序效應；(5)其他因素，如外植體、營養條件、碳源種類和濃度等理化因素。
(2)胚胎發生
胚胎發生植株再生是先形成胚狀體，然後通過胚狀體萌發形成完整的植株。胚胎發生是高等植物中的普遍現象，據觀察，屬於40多個科的150多種植物具有胚胎發生能力。關於胚狀體的概念，朱坤提出(1978)胚狀體是起源於植物組織培養中的非合子細胞，通過胚胎發生和胚胎發育形成的胚狀結構。這個定義包括以下含義:(1)胚狀體是組織培養的產物，僅限於在組織培養中使用，不同於無融合生殖胚；(2)胚狀體起源於非合子細胞，不同於合子胚；(3)胚狀體的形成經歷了胚胎發育的過程，不同於組織培養中的分化芽。
胚狀體的來源可分為五類:(1)組織和器官；(2)愈傷組織；(3)遊離單細胞；(4)小孢子；(5)原生質體。有些起源於單細胞，有些起源於多細胞。胚狀體的形成有兩種方式(Sharp et al，1980): (1)直接:胚狀體的形成直接來源於壹個預先確定的胚胎細胞體外培養組織，無愈傷組織；(2)間接發生:胚胎發生通過愈傷組織，由愈傷組織發育成誘導胚胎決定細胞。在培養體系中相關因素的影響下，胚胎細胞不斷分裂增殖，形成胚胎細胞團，進而發育成球形胚胎。通常，胚胎細胞體積小，細胞核大，細胞質致密，澱粉粒大。球形胚胎組織可與周圍組織分離，這與合子胚胎的發育過程相似。球形胚發育並分化為心形胚、魚雷形胚和具有子葉的成熟胚。成熟胚狀體在形態上與合子胚相似，有胚根、胚和子葉。在分化培養基上，胚狀體像種子壹樣萌發，下胚軸伸長，葉子展開，根發育並形成葉綠素，各種器官進壹步生長形成小植株。胚狀體的形成導致了人工種子的發展。
胚胎發生到植株形成是壹個連續的過程，可分為三個連續的階段:(1)胚狀體的起源；(2)胚狀體分化；(3)胚狀體萌發並生長形成小植株。實踐中，胚胎細胞的誘導和胚狀體形成的發育過程可能在同壹培養基上形成，也可能需要分別進行兩次培養。當胚狀體形成綠色植株時，需要轉移到分化培養基上。如果培養基中的化學物質，主要是植物激素，不平衡。胚胎細胞的分化和胚狀體的發育會受到抑制，出現異常的胚胎組織塊。這些畸形結構也可能具有胚胎發生的潛能。
胚胎發生和植物激素的關系因植物而異，可分為幾種類型:
1.特定生長素類型
胚胎發生必須有生長素，其他植物激素的存在起抑制作用。這種類型有兩種情況:(1)生長素是誘導胚胎細胞所必需的，生長素，如胡蘿蔔，是胚狀體形成和發育所需要減少或去除的；(2)胚狀體的誘導和發育可以在相同的生長素培養基上進行。比如人參。
2.非特異性生長素類型
胚胎發生需要生長素，其他植物激素如細胞分裂素、赤黴素或脫落酸在壹定比例下有協同作用，如大棗。
3.非生長素類型
胚胎發生不需要生長素，可以在細胞分裂素培養基上形成，如檀香。
4.非激素型
胚胎發生不需要植物激素，比如曼陀羅花培養。
胚狀體通常需要減少或去除生長素才能分化出綠苗，細胞分裂素和赤黴素起主要作用，如人參和西洋參。
還原性氮化物在體細胞胚胎發生中起重要作用。還原的氮化物包括無機氮，例如NH+4；有機氮化物，如氨基酸、酰胺、水解酪蛋白等。正常情況下，還原態氮化物有利於胚狀體的形成，但作用機制尚不明確，不同植物反應不同。許多研究表明，生長素和還原態氮化物的濃度比可能起重要作用。
不同的植物，不同的離體培養，再生植株的途徑可能不同，有的主要是通過器官發生，比如煙草，有的容易產生胚狀體，比如胡蘿蔔。然而，許多植物可以通過器官發生和胚胎發生再生植株，植物激素可以調節，如人參和西洋參。壹般誘導芽分化需要細胞分裂素，生長素在誘導胚狀體形成中起著重要作用。
離體培養，芽和胚狀體是有分化的，它們的主要區別有:芽是單極的，與離體培養有維管組織聯系，根和芽不是同時產生的；胚狀體是兩極的，即有根尖(胚根)和莖尖(胚)，與離體培養沒有直接聯系，所以是完整的植物胚胎形態。體細胞胚胎發生的發展導致了人工種子的發展。
第四，植物再生的限制因素
(壹)植物再生的限制因素
離體培養再生植株可分為三類調控因素:外植體、培養基和環境條件。在這三個因素中，雖然都起著重要的作用，但相比較而言，植物再生成功的限制因素不是培養基，而是培養材料本身，即培養材料的細胞全能性的表達程度。
1.基因型的影響
不同植物種類之間再生能力差異很大，有些再生能力很強，如茄科、傘形科、十字花科等。有些很難再生，比如豆科植物。同壹植物的不同品種具有不同的再生能力。由於遺傳類型的影響，決定了植物再生的難度和應用前景。我們在對五加科藥用植物人參、西洋參、三七、刺五加的胚培養進行研究時，得到了如下結果:(1)在附加BA2mg/l+NAA0.5mg/l的培養基上，人參、西洋參的胚培養能直接啟動芽分化，轉移到含有赤黴素的培養基上會形成不定芽，而三七、刺五加無芽分化。(2)在含有生長素的培養基上，這四種藥用植物的胚培養物中都存在胚狀體，但它們對生長素的種類和濃度有不同的反應。當添加2，4-D 0.5—1.0 mg/L時，胚胎發生能力為西洋參>人參>刺五加，而三七未觀察到胚胎發生。在含有IAA的培養基上，高濃度的IAA促進人參種子的體細胞胚胎發生，而低濃度的IAA適合三七和刺五加。(3)在上述生長素條件下，人參和西洋參為間接胚胎發生，三七和刺五加為直接胚胎發生。
2.外植體的來源
體外培養，可用於培養的材料有很多，包括器官、組織甚至單細胞。雖然植物細胞是全能性的，但其表達可能僅限於某些特殊的細胞，這些細胞可能預先存在於外植體中，也可能在培養過程中產生。許多實驗表明，培養材料的特性不僅影響再生的可能性，而且影響植物的生長速度和質量。在選擇培養材料時，可以觀察到分生組織容易分化，子葉基部再生強烈，成年樹的葉片可能可逆性差，細胞全能性難以表達。當我們在體外研究西洋參的再生植株時，來自不同外植體的愈傷組織表現出不同程度的細胞全能性(表13—10)。
表13—10西洋參不同外植體愈傷組織細胞全能性的表達程度
3.外植體的狀態
外植體的發育階段和年齡、外植體的內源激素和生理狀態(取樣季節)、外植體的大小、外植體的預處理和母株的質量都影響著植株再生的成功。在選擇外植體時，需要了解植物的生物學特性。
(2)外植體的類型和選擇
離體培養，外植體有多種材料，可根據研究目的、再生途徑和實驗經驗進行選擇。
1.帶芽外植體
包括莖頭、側芽、原球莖、鱗莖等。這些外植體成功率高，變異性小，易於保持材料的優良特性，通常用於脫毒植株的快速繁殖和培養(莖尖培養)。在培養中，為了誘導莖軸的伸長，常常在培養基中加入生長素和赤黴素；如果誘導腋芽生長產生叢生芽，培養基中往往有大量的細胞分裂素。
2.由分化組織組成的外植體
包括莖段、葉、根和其他營養器官；花莖、花瓣、花萼、花藥、子房、胚珠、果實等生殖器官。這類外植體通常在培養過程中形成愈傷組織，通過器官發生和胚胎發生再生植株。器官發生再生的植物通常選擇在自然條件下能產生不定芽的器官和組織，要根據不同植物的特性進行選擇，如蘆薈為莖段，菊花為花瓣，百合為鱗片。胚胎、幼花序和分生組織經常通過胚胎發生被用作外植體。這類外植體可用於克隆變異和突變體篩選，或用於單倍體育種，如花粉植株。
3.由遺傳轉化細胞組成的外植體
主要指植物基因工程中使用的冠癭轉化系統和DNA直接轉化系統。
動詞 （verb的縮寫）再生植物的培養方法
(1)再生植株的培養步驟
1.建立無菌培養。
這壹步驟包括外植體的選擇、材料的表面滅菌和在培養基上的接種。能否得到無菌培養取決於植物材料的情況，盡可能使用培養室或溫室中種植的健康旺盛的材料。田間材料的消毒比較困難，所以經常采用以下方法:(1)用抗生素溶液和殺菌劑對植物進行預處理；(2)用塑料袋包裹樹枝；(3)收集枝條進行扡插，利用新芽；(4)對培養料進行多次滅菌。壹些植物外植體在接種後和培養過程中變成褐色。可以向培養基中加入壹些抗氧化劑、解毒劑或吸附劑，如檸檬酸、抗壞血酸、半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、二硫蘇糖醇、生長促進劑、氯黴素、二乙基二硫代氨基甲酸酯、活性炭等。，以改善褐變情況。
2.愈傷組織培養
愈傷組織是植物組織培養中最常見的階段。為了快速繁殖遺傳壹致的優良品系，使變異小於3%，需要盡可能避免愈傷組織。但在品種改良中，誘導愈傷組織是有益的。
愈傷組織通常由外植體傷口的表面細胞產生。愈傷組織的生長特性取決於植物材料、培養基和環境條件。從外植體到愈傷組織的建立，壹般要經歷誘導、細胞分裂和分化幾個階段。在外界條件特別是植物激素的作用下，少數細胞啟動，代謝加強，進入活躍的細胞分裂，外植體細胞逆轉為分生組織或脫分化為愈傷組織。愈傷組織的生長沒有明顯的極性，只有內外生長陡度，外圍細胞分裂生長快於內部細胞。第三階段，愈傷組織分化並產生壹些次生代謝產物。愈傷組織最重要的特點是能通過器官發生或胚胎發生形成根、芽和胚狀體，進而形成小植株。
老繭通常是淡黃色，白色和綠色，有些含有花青素形成的顏色。愈傷組織有疏松型和致密型。在繼代培養中可以人工選擇同壹來源的愈傷組織，得到不同的細胞系。它們在細胞分化、顏色、生長速度、對營養和激素條件的要求以及合成特殊物質的能力方面有很大的差異。變異是愈傷組織的另壹個重要特征。這些變異包括表型變異和基因型變異。基因型變異可能包括倍性改變、染色體畸變和基因序列改變。有益變異的選擇可用於品種改良。
外植體形成愈傷組織與植物激素的關系如下:(1)只需要生長素；(2)只需要細胞分裂素；(3)需要生長素和細胞分裂素；(4)不需要植物激素。大多數情況下，生長素是誘導愈傷組織的主要因素。
在培養過程中，由於營養物質的逐漸耗竭，瓊脂脫水逐漸變幹，代謝產物積累，增加了毒性。愈傷組織培養需要轉移到新鮮培養基上進行壹段時間的繼代培養。在固體培養基上，通常每4-6周進行壹次繼代培養。轉移的培養物約5-10 mm，重約20-100 mg(街，1969)。如果體積太小，它可能生長緩慢或不生長，但是當篩選抗性時，培養物的體積更小。愈傷組織繼代培養基和脫分化培養基的成分和激素條件可以相同，也可以不同，因植物而異。由於長期繼代培養增加了內源激素的含量，需要適當調整繼代培養基中激素的種類和含量。
3.克隆的建立
從體外培養建立克隆常常會遇到變異、細胞分化能力喪失、玻璃苗等問題。每種植物的離體培養都需要大量的實驗來確定最佳的培養條件，並使之程序化，才能達到應用的目的。建立克隆體的方法大致可以用圖13-2來表示。
圖13-2克隆建立4示意圖。生根的
芽和芽誘導生根的難易程度首先取決於植物的遺傳類型。草本植物壹般比木本植物容易。成年樹產生的芽和枝比幼樹更難生根。為了誘導生根，通常在生根培養基中加入適量的生長素，如萘乙酸、吲哚丁酸和吲哚乙酸。有些植物可以在無激素的培養基上生根。生根培養基可與前壹種培養基相同，常用濃度為1/2、1/3或1/4的高鹽培養基或總鹽濃度低的培養基。鐵鹽有利於根的形成，壹般維持原有濃度。蔗糖是生根所必需的，不同的植物可能需要不同的量。
有些難以生根的植株可以嘗試壹些其他方法:(1)用高濃度生長素溶液預處理幾個小時，然後用無菌水沖洗，接種到無激素培養基中；(2)用濾紙橋或蛭石代替瓊脂作載體誘導生根；(3)在生根培養基中添加壹些添加劑，如活性炭、B9、二甲基亞碸、根皮苷、間苯三酚等。(4)在試管中誘導休眠器官，如小塊莖、小鱗莖和地下莖；(5)扡插嫩枝，直接扡插或水培。
移植
有些植物容易移栽，如蘆薈試管苗直接移栽到土壤中成活率可達100%，而人參試管苗移栽尚無成功報道。對於許多植物來說，有必要研究它們特殊的移植技術。
(1)培育壯苗，移栽前鍛煉。
(2)逐步過渡:首先是人工基質，如蛭石、沙子、珍珠巖、煤渣、芯土等。被引入土壤中。對於易感病害的植物，可以通過高溫、化學滅菌或化學消毒等方法對人工基質進行滅菌。
(3)選擇適宜的移栽期。許多木本植物和壹些草本植物在根原基突出或形成幾毫米的短根時成活率最高。有些草本植物可以通過二次生根誘導，第壹次生根老化後再誘導新根移栽。
(4)控制移栽的環境條件，保持高濕度和良好的通風，避免陽光直射和溫度波動過大。有些植物需要模擬它們的生態環境。
(5)及時防控疾病。常見的病害是猝倒病，可以用多菌靈等農藥定期噴苗、噴基質。
(6)嫁接試管苗。
(2)培養基和環境條件
1.中等
根據培養材料和目的，植物組織培養可分為許多類型，如器官培養、莖尖培養、花藥和花粉培養、子房和胚珠培養、胚培養、胚乳培養、果實培養、細胞懸浮培養、分生組織培養、愈傷組織培養、原生質體培養和細胞融合。不同的植物和不同種類的組織培養需要不同的培養基。目前，可用於植物組織培養的培養基約有250種。對於壹般的離體繁殖，為了降低生產成本，有的采用簡化培養基，用食用糖代替試劑和蔗糖，用普通水代替蒸餾水配制培養基。靜態淺層液體培養比瓊脂固體培養可降低成本70-80%，已用於壹些植物的快速繁殖。
2.環境條件
包括培養基的pH值、培養溫度、光照條件和通風條件。
壹般植物組織生長的最適pH在5-6.5之間，固體培養基通常為pH5.8，液體培養基通常為pH5.0。
培養溫度壹般在20-28℃左右。高溫(27℃左右)適合熱帶品種，低溫(20℃左右)有利於高山植物的離體培養。鱗莖、塊莖等休眠器官在試管中形成時，其萌發往往需要低溫處理。
愈傷組織培養壹般可以在黑暗中進行。光自養的離體培養、器官發育和植物形成都需要光。光照強度範圍為300-1000—3000lx，壹般為1000-3000lx。壹般培養室可以設計用自然光代替日光燈。有研究表明，不同波長的色光對愈傷組織形成和器官分化有壹定的影響，並且因植物種類和器官而異。光照時間取決於植物特性和實驗目的，可以是連續光照或周期性光照10-16小時。塊莖和其他貯藏器官的形成可能需要壹個漫長的黑暗期。在研究花器官發生時，需要根據植物特性控制光照時間。
通常，在固體培養基中不能考慮空氣成分，盡管在培養過程中會產生乙烯。液體培養需要註意通風。細胞懸浮培養壹般采用振蕩法通氣。在器官分化中，可以用旋轉床使組織在液體培養基中間隔生長。小體積靜態淺液培養需要縮短培養時間，每四周傳代壹次。為了保存繁殖材料，仍應使用固體培養。
不及物動詞中國藥用植物離體再生研究概況
在藥用植物的栽培和生產中，很多珍貴的藥用植物生長周期很長，采用常規育種需要很長時間，如人參、黃連等。壹些藥用植物，如貝母、藏紅花等。繁殖系數小，種子消耗量大。有的被病毒降解，影響產量和質量，如地黃、太子參等。壹些昂貴的野生藥用植物資源少，生長緩慢，如黑蓼、霍山石斛等。壹些進口的南方藥材，如乳香、龍血竭等，都受到苗荒的影響。為了應用植物生物技術進行藥用植物的品種改良、快速繁殖、種質保存和基因工程研究，藥用植物離體再生的研究和應用日益受到人們的關註。
目前離體藥用植物有100多種，如爵床科九獅。獼猴桃科，獼猴屬。物種毛獼猴桃變種。hispide，夾竹桃科長春花，夾竹桃，蘿芙木，刺五加，人參，竹節參，西洋參，西洋參，三七，三七，印度海鞘。