根據所用原料的不同,可分為兩類:用肉湯、馬鈴薯汁等天然成分配制的天然培養基;用化學藥品配制並標明成分的培養基稱為合成培養基或綜合培養基。化學試劑中的介質大部分是合成介質。因為液體介質不容易長時間保存,所以現在轉化成了粉末。由於原料不同,培養基的貯存要求也不同,貯存和保存也略有不同。壹般培養基受熱吸潮後容易被細菌汙染或分解,必須保存在防潮、避光、陰涼的地方。其中壹些需要嚴格消毒。
常見的媒體有:
1,細菌培養基
配方1牛肉膏瓊脂培養基
牛肉醬0.3g,蛋白腖1.0g,氯化鈉0.5g,瓊脂1.5g,
水100毫升
在燒杯中加入100 ml水,加入牛肉醬、蛋白腖和氯化鈉,用蠟筆在燒杯上做標記,在火上加熱。待燒杯中的成分全部溶解後,加入瓊脂,不斷攪拌,以免粘底。當瓊脂完全溶解後,彌補水分損失,用10%鹽酸或10%氫氧化鈉調節pH值至7.2 ~ 7.2。
配方II馬鈴薯培養基
取250g新鮮牛心(不含脂肪和血管),用刀細細剁成肉末,加入500ml蒸餾水和5g蛋白腖,在燒杯上做好標記,煮沸,小火燉2h。過濾,將過濾後的肉末幹燥,將濾液的pH值調至7.5左右。在每個試管中加入10ml肉湯和少量牛心碎,滅菌備用。
配制根瘤菌培養基
葡萄糖10g磷酸氫二鉀0.5g
3克碳酸鈣和0.2克硫酸鎂。
酵母粉0.4g,瓊脂20g。
水1000ml 1%結晶紫溶液1ml。
先將瓊脂加水煮沸溶解,再加入其他成分,攪拌溶解,包裝滅菌備用。
2.放線菌培養基
配方1澱粉瓊脂培養基(高斯培養基)
可溶性澱粉2g,硝酸鉀0.1g。
0.05克磷酸氫二鉀和0.05克氯化鈉。
0.05克硫酸鎂和0.001克硫酸亞鐵。
瓊脂2g水100ml。
先將澱粉放入燒杯中,用5毫升水調成糊狀,然後倒入95毫升水,攪拌均勻,再加入其他藥物使其溶解。在燒杯外側做好標記,加熱至沸騰時加入瓊脂,不斷攪拌直至瓊脂完全溶解,以彌補水分的損失。調節pH值至7.2 ~ 7.4,分裝滅菌備用。
配方II面粉瓊脂培養基
面粉60g,瓊脂20g。
水1000毫升
用水調成面糊,加水至500毫升,文火煮30分鐘。另取500 ml水,加入瓊脂,加熱煮沸至溶解,將兩種液體混合均勻,補水,調pH至7.4,分裝,滅菌備用。
3.真菌培養基
沙氏培養基的配方
蛋白腖10g瓊脂20g
麥芽糖40g水1000ml。
首先,在蛋白腖和瓊脂中加入水,然後加熱並不斷攪拌。瓊脂溶解後,加入40克麥芽糖(或葡萄糖),攪拌溶解,然後包裝滅菌備用。
這種培養菌株通常用於培養多種真菌。
式II馬鈴薯糖瓊脂培養基
土豆洗凈去皮,200克切成小塊,加1000毫升水,煮半小時,補足水。在濾液中加入10克瓊脂,煮沸溶解,再加入20克糖(培養黴菌用蔗糖,培養酵母菌用葡萄糖),補足水,分裝,滅菌備用。
將此培養基的pH值調至7.2 ~ 7.4,配方中的糖如葡萄糖也可用於培養放線菌和芽孢桿菌。
配方豆芽汁培養基
黃豆芽100g瓊脂15g。
葡萄糖20g,水1000ml。
黃豆芽洗凈,加水煮沸30分鐘。用紗布過濾,濾液中加入瓊脂,加熱溶解後加入糖,攪拌使其溶解,將水補足至1000 ml,包裝滅菌備用。
調節這種培養基的pH值到7.2 ~ 7.4,可以用來培養細菌和放線菌。
配方四豌豆瓊脂培養基
豌豆80瓊脂5g
水200毫升
將80粒幹豌豆加水,煮沸65438±0小時,用紗布過濾,濾液加入瓊脂,煮沸至溶解,分裝,滅菌備用。
4.食用菌培養基
配方1馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養基
20%馬鈴薯汁1000毫升
蔗糖20g,瓊脂18g。
土豆洗凈去皮後,切成小塊。稱取200克土豆塊,加入1000毫升水,煮沸20分鐘,然後過濾。將過濾後的汁中的水補足到1000 ml,即制成20%的馬鈴薯煮汁。在土豆煮汁中加入瓊脂和蔗糖,煮沸,使其溶解,加水,包裝,滅菌。
配方二馬鈴薯綜合培養基
20%馬鈴薯汁1000毫升
磷酸二氫鉀3g硫酸鎂1.5g。
葡萄糖20g,維生素10 mg。
瓊脂18g
首先,準備20%煮土豆汁。方法同上。將上述成分加入煮沸的果汁中,加熱溶解後加水,調節pH值至6。分裝,滅菌備用。該培養基用於培養和保存食用菌如靈芝、平菇和香菇。
5.煙草培養基
在植物組織培養中,通過調節IAA與CTK的比例,愈傷組織可以分化成根或芽。當CTK/IAA較高時,愈傷組織能分化出芽。
當CTK/IAA較低時,根系分化;適度的CTK/IAA比率維持愈傷組織的未分化。
愈傷組織誘導培養基的制備
以MS培養基母液為基礎,在幹凈的鋁鍋中依次加入大量元素20×母液100mL、微量元素100×母液20mL、鐵鹽100×母液20mL、維生素100×母液20mL、肌醇200×母液10mL。制備MS培養基後,加入0.5 mg L-1 Ba8ml和0.5 mg L-1 NAA8mL,然後加入約為所制備培養基實際體積2/3-3/4的蒸餾水,加入40g蔗糖,攪拌使其溶解。用0.5摩爾L-1 NaOH和0.5摩爾L-1 HCl調節pH值至5.8-6.0。加入14g瓊脂,將鋁鍋置於電爐中,攪拌加熱使瓊脂完全溶解,然後用蒸餾水使體積達到2L的最終體積,繼續加熱幾分鐘使其混合均勻,然後分裝於三角瓶中。
煙草葉片愈傷組織的誘導
取壹個無菌培養皿,用手術刀切開1-2無菌苗葉,放入無菌培養皿中,使用溶液
用切割刀將葉片切成2mm2左右的小塊,然後接種在準備好的培養基上,每瓶接種。
五小塊,壹* * *接種6瓶。接種的三角菌在24種條件下在黑暗中培養65438±0周,然後在相同條件下培養
將樣品在光照和完全黑暗中培養3周,直到形成愈傷組織(每種情況下3瓶)。
觀察愈傷組織誘導結果,統計愈傷組織誘導率。
器官分化和植物再生培養
將誘導的愈傷組織根據它們的類型轉移到分化培養基上,在連續光照和20-22℃的溫度下培養3周,並對愈傷組織的植株再生進行計數。
愈傷組織誘導概況
煙草愈傷組織誘導培養4周後,基本形成愈傷組織,即排除了愈傷組織是生長時間不足造成的
沒有形成愈傷組織。詳情見表1。在所有六個培養瓶中都形成了愈傷組織,但沒有壹個發展起來。
汙染,但誘導率相差無幾。其中,光照條件下培養的三個瓶子的平均愈傷組織誘導率為100%
60.0℅,黑暗條件下培養的三瓶平均愈傷組織誘導率為46.7%。由於實驗中的外植體,
煙葉體積太小,接種時部分外植體的大部分細胞可能已經脫水死亡,使整株
本試驗的愈傷組織誘導率低,愈傷組織小。
培養基還包括:1640培養基。
特殊介質:
選擇性媒介
1酵母增菌培養基
葡萄糖5%尿素0.1%硫化銨0.1%磷酸二氫鉀0.25%磷酸氫二鈉0.05%七水硫酸鎂0.1%七水硫酸鐵0.01%酵母抽提物0.05%。
孟加拉紅0.003% pH4.5
自養固氮菌在阿什比無氮培養基中的富集培養
甘露醇1%磷酸二氫鉀0.02%七水硫酸鎂0.02%氯化鈉0.02%
二水硫酸鈣0.01%碳酸鈣0.5%
兩種差分介質
EMB培養基,常用於鑒定大腸桿菌
蛋白腖10g乳糖5g蔗糖5g磷酸氫二鉀2g曙紅Y 0.4g亞甲藍0.065g
蒸餾水1000g pH7.2
壹種分離海洋微生物的培養基配方
2216E培養基配方(固體培養基)
蛋白腖5g
酵母泥1克
0.01克磷酸鐵
瓊脂15-20g
陳海水1000ml
將氫氧化鈉溶液(5%)煮沸,以調節PH值至7.6-7.8。
其他媒體:
1.高的第壹介質
KNO3:1g,
氯化鈉:0.5克,
磷酸二氫鉀:0.5克
硫酸鎂·7H2O:0.5g
七水硫酸亞鐵:0.01克
可溶性澱粉20g
瓊脂20g
蒸餾水1000毫升
調節pH至7.2 ~ 7.4,121℃滅菌30分鐘。
方法:先將澱粉用少量水調成糊狀,再將700ml水放在電爐上加熱煮沸。
然後邊攪拌邊倒入澱粉糊,同時保持沸騰,再加入其他配料。
溶解後,加水至1000毫升。
肉湯蛋白腖斜面:
蛋白腖10g
牛肉醬5g
蒸餾水1000毫升
氯化鈉:5克
Ph: 7.0 ~ 7.2,121℃殺菌20min。
如配制固體培養基需要瓊脂1.5%~2%,半固體培養基可添加瓊脂0.5%~0.8%。
不同細胞培養基
天然細胞培養基
天然培養基是指來源於動物體液或通過組織分離提取的壹類培養基,如血漿、血清、淋巴液、雞胚提取液等。在組織培養技術的早期,采用天然培養基進行細胞的體外培養。但由於生產工藝復雜,批次間差異大,天然培養基逐漸被合成培養基取代。目前廣泛使用的天然培養基是血清,各種組織提取物和促進細胞黏附的膠原物質在壹些特殊細胞的培養中也是必不可少的。
血清類型
目前用於組織培養的血清主要是牛血清,壹些特殊細胞也用人血清、馬血清等進行培養。選擇牛血清進行細胞培養的原因是:來源充足,制備技術成熟,經過長時間的應用試驗,人們對其有了更深入的了解。牛血清適用於大多數哺乳動物細胞,但不排除在培養某些細胞時使用其他動物血清更合適。
牛血清是細胞培養中使用最多的天然培養基,含有豐富的細胞生長所必需的營養物質,具有極其重要的功能。牛血清可分為小牛血清、新生牛血清和胎牛血清。胎牛血清應通過剖腹產取自胎牛。新生牛血清取自出生後24小時內的新生牛;小牛血清取自出生於10-30天的小牛。顯然,胎牛血清的質量是最高的,因為胎牛沒有接觸過外界,血清中含有的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。
血清的主要成分
血清是壹種非常復雜的混合物,通過從血漿中去除纖維蛋白而形成。雖然其成分大部分已知,但仍有部分未知,血清的成分和含量往往隨獻血者的性別、年齡、生理狀況和營養狀況而變化。血清中含有各種血漿蛋白、肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等。,它們在促進細胞生長或抑制生長活性方面處於生理平衡。
血清的主要作用
1.提供基礎營養素:氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等。,是細胞生長的必需物質。
2.提供激素和各種生長因子:胰島素、腎上腺皮質激素(氫化可的松、地塞米松)、類固醇激素(雌二醇、睪酮、孕酮)等。生長因子,如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。
3.提供結合蛋白:結合蛋白用於攜帶重要的低分子量物質,如白蛋白攜帶維生素、脂肪和激素,轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝中起重要作用。
4.提供接觸促進和拉伸因子,以防止細胞粘附受到機械損傷。
5.對培養中的細胞有壹定的保護作用:有些細胞,如內皮細胞、骨髓樣細胞等,能釋放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起中和作用。這種效應是偶然發現的,現在有目的地用血清來阻止胰蛋白酶的消化。因為胰蛋白酶已經廣泛用於貼壁細胞的消化和傳代。血清蛋白形成了血清的粘度,可以保護細胞免受機械損傷。尤其在懸浮培養中,粘度起著重要的作用。血清中還含有壹些微量元素和離子,對新陳代謝和解毒有重要作用,如SeO3和硒。
血清培養基的主要問題
1.血清成分可能有數百種,但確切的組成成分、含量和作用機制尚不清楚,尤其是壹些多肽生長因子、激素和脂類等還不完全了解,給研究工作帶來很多困難。
2.血清是批量生產的,批次之間差異很大,血清的保存期最多壹年。因此,保證每批血清的相似性極其困難,限制了實驗的規範性和連續性。
3.對於大多數細胞來說,在體內,血清並不是它們接觸的生理液體,只是在損傷愈合和血液凝固的過程中,所以使用血清可能會改變體內某些細胞的正常狀態,血清可能會促進某些細胞(成纖維細胞)的生長,抑制另壹類細胞(表皮細胞)的生長。
4.血清中含有壹些對細胞有毒性的物質,如多胺氧化酶,可與高增殖細胞產生的多胺(如精胺、亞精胺)反應,形成具有細胞毒作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素都會影響細胞生長,甚至導致細胞死亡。
5.不同動物的血清來源和批號不同,每批質量差異很大,其成分不可能壹致。
6.支原體和病毒可能被帶入樣品,對細胞有潛在影響,可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠。
7.在大規模生產中,血清的來源越來越困難和昂貴,這是動物細胞培養生產成本的主要部分之壹。
血清質量標準
血清的質量取決於兩個因素:壹是取樣對象,二是取樣過程。用於取樣的動物應健康無病,並在規定的出生日期內。采樣過程要嚴格按照操作規程進行,制備的血清要經過嚴格的質量鑒定。世衛組織頒布的《動物細胞體外培養生產生物制品規程》中的要求:
1.牛血清必須來自牛或有文件證明沒有牛海綿狀腦病的國家,並應有適當的監測系統。
2.壹些國家還要求牛血清來自從未使用過反芻動物蛋白飼料的牛。
3.證明所用的牛血清不含所產生疫苗病毒的抑制劑。
4.血清要用過濾膜滅菌,保證無菌。
5.無細菌、黴菌、支原體和病毒汙染,部分國家要求無噬菌體汙染。
6.有很好的支持細胞繁殖的效果。
我國在2000版《中國生物制品主要原料及輔料質量控制標準》中對牛血清的質量提出了嚴格的標準,包括蛋白質含量、細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素,支持細胞增殖檢查。