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瓊脂糖凝膠電泳的原理是什麽?

瓊脂糖凝膠電泳原理:瓊脂糖凝膠電泳是壹種常用的分離和鑒定DNA和RNA分子混合物的方法。這種電泳方法以瓊脂糖凝膠為支持物,利用DNA分子在遊動過程中的電荷效應和分子篩效應,達到分離混合物的目的。

DNA分子在高於其等電點的溶液中帶負電荷,並在電場中向陽極移動。在壹定的電場強度下,DNA分子的遷移速度取決於分子篩效應,即分子本身的大小和構型是主要影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。

不同構型的DNA分子遷移速度不同。例如,壹個環狀DNA分子樣本,其中有三種分子構型:閉環超螺旋分子(cccDNA)、開環分子(ocDNA)和線性DNA分子(IDNA)。這三種不同構型的分子在電泳過程中的遷移速度順序為CCCNA > IDNA > OCDNA。

核酸分子是兩性解離分子,pH3.5是堿基上的氨基解離,三個磷酸基團中只有壹個解離,所以分子帶正電,在電場中向負極遊去。然後呢。在pH8.0-8.3時,堿基幾乎不可分,而磷酸基團遊離,所以核酸分子帶負電,在電場中向正極遊去。

不同核酸分子的電荷密度幾乎相同,所以對遊泳速度影響不大。中性或堿性時,單鏈DNA的遷移率幾乎與相同長度的雙鏈DNA相同。

擴展數據

影響核酸分子流動性的因素

1,樣品的物理性質

即分子的大小、電荷數、粒子形狀和空間構型。壹般來說,電荷密度越大,遊動速率越大。而不同核酸分子的電荷密度幾乎相同,所以對遷移率的影響並不明顯。

對於線性分子,分子量的常用對數與遊泳速度成反比。用此標準樣品進行電泳並測定其遊動速率,然後以DNA分子長度(BP)-遊動距離的負對數作為標準曲線,就可以用來測定未知分子的長度。

DNA分子的空間構型對遷移率有很大影響,如質粒分子。遷移率順序為cDNA > cDNA>IDNA>ocDNA。但由於瓊脂糖濃度、電場強度、離子強度和溴化乙錠的影響,會出現相反的情況。

2.支持介質

核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠,瓊脂糖是帶有高分子鏈的線性分子。含有不同濃度瓊脂糖的凝膠組成的分子篩具有不同的篩孔大小,用於分離不同濃度範圍的核酸分子。聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺(Acr)在N,N,N′-四甲基四乙烯四胺(TEMED)和過硫酸銨(AP)的催化下聚合而成,由N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)交聯而成。篩目尺寸由Acr與Bis的相對比例決定。

瓊脂糖凝膠適合分離長度為100到60的分子,聚丙烯酰胺凝膠分離小片段(5bp-500bp)效果最好。選擇不同濃度的凝膠可以分離不同大小的DNA分子。

3.電場強度

電場強度越大,壹些粒子的遊動速度越快。而凝膠的有效分離範圍隨著電壓的升高而減小,所以電泳壹般采用低電壓,不超過4V/cm。大片段電泳,甚至用了0.5-1.0V/cm電泳過夜。只有聚丙烯酰胺凝膠可以用於高壓電泳。

4.緩沖溶液的離子強度

TAE?TBE和TPE緩沖系統,但它們各有優缺點。TAE便宜,但緩沖能力低,需要循環雙極緩沖。TPE回收DNA時會汙染磷酸鹽,影響後續反應。因此,經常使用緩沖劑。

在緩沖液中加入EDTA可以螯合二價離子,抑制DNA酶,保護DNA。

緩沖液的pH值通常是堿性或中性的,此時,核酸分子帶負電並向正極移動。

核酸電泳常用的染色劑是溴化乙錠(乙錠?溴化物?EB).溴化乙錠是壹種扁平分子,可以嵌入雙鏈核酸的成對堿基之間。當BE-DNA復合物被紫外線照射時,出現不同的效應。

254nm紫外線照射時,靈敏度最高,但DNA損傷嚴重;用360nm紫外線照射時,靈敏度較低,但對DNA的損傷較小,適用於DNA樣品的觀察和回收。300nm紫外線照射的靈敏度高,對DNA的損傷也不大,所以也適用。

用溴化乙錠對DNA樣品進行染色,可在凝膠中加入終濃度為0.5μg/ml的EB。當EB混入DNA分子時,在電泳過程中隨時可以觀察到核酸的遷移。但如果要測定核酸分子的大小,則不應采用上述方法,而應在電泳後將凝膠浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中10 ~ 30 min。BE會被光分解,應在4℃避光保存。

參考資料:

百度百科-瓊脂糖凝膠電泳

參考資料:

百度百科-凝膠電泳