許多研究表明,灰樹花多糖主鏈中存在β-(1→3)-、β-(1→4)-和β-(1→6)葡聚糖,其中β-(1→3)葡聚糖最為重要。側鏈是β-(1→6)-和β-(1→3)葡聚糖。提取物的中性成分主要含有側鏈C-6分支的α-(1→4)-和β-(1→3)-葡聚糖。酸性成分主要含有β-(1→3)-葡聚糖。類似的雲芝糖肽主要含有主鏈β-(1→3)-和β-(1→4)-和側鏈β-(1→6)-葡聚糖,所以口服也能抑制小鼠S-180腫瘤。
(二)多糖的構象與活性已知灰樹花多糖有天然和螺旋兩種構象。子實體中的葡聚糖呈天然構象,不同提取方法得到的化學成分不同。不同構型的葡聚糖具有不同的活性。Ohno(1986)證明了在提取純化過程中,某些天然形式可以轉化為螺旋形式(用尿素透析後)。與茯苓多糖(茯苓多糖)轉化為U-茯苓多糖(後者具有抗癌活性)不同,灰樹花的兩種構象都具有抗癌活性。灰樹花在熱水或堿提取過程中,肽鍵可能斷裂,從而發生構象轉變,影響其抗癌活性。
(3)活性灰樹花多糖的提取方法和生產。目前主要從子實體、固體培養菌絲體和液體培養菌絲體中分離提取。Ohno證明了灰樹花子實體中的葡聚糖存在於細胞壁中,所以必須提取裏面的葡聚糖。大野推測,灰樹花提取物進入消化道後,在酶的作用下,抗癌活性結構被釋放出來,表現出活性。Hishida報道舞茸提取物的腹腔給藥無效,口服給藥顯示抗癌作用,這似乎支持了Ohno的假說。而Ohno等(1984)以6種不同方式獲得的提取物,給接種了S-180腫瘤的小鼠腹腔註射。四組劑量分別為40、400、4000 μ g/(僅壹天)×10天,抑瘤率大於90%。其中熱堿提取的水溶性CF-7成分抗癌活性最高,其結構為帶側鏈的C-6 β-(1→3)葡聚糖。熱水提取物中含有大量的α-(1→4)-葡聚糖,而冷堿和熱堿提取物中含有大量的β-葡聚糖。因此,熱堿提取物具有更高的抗癌活性。黑田(1983)報道灰樹花熱水提取物也有活性,推測其活性結構為C-3側鏈β-(1→6)葡聚糖。
基於很多研究可以看出,灰樹花子實體含有8%左右的細菌多糖,其熱水提取物、冷堿提取物和熱堿提取物的主體結構基本相同。從腸道吸收來看,分子量小的更容易透過腸黏膜,而熱堿提取物分子量小。
最常用的提取方法是熱水提取,但也有乙醇和稀堿提取。同壹批原料用不同的溶液提取,多糖成分不同。用稀堿提取時,常加入硼氫化鈉或硼氫化鉀,以減少多糖的降解。多糖的提取率比熱水法高,但由於果膠的存在,粘度大,要趁熱過濾。乙醇提取的多糖雜質少,易於過濾。熱水提取液必須離心或過濾,液體減壓濃縮至壹定體積,加入95%冷乙醇使乙醇終濃度達到70% ~ 80%,即可得到多糖沈澱,用丙酮醚洗滌,幹燥,得粗多糖產品,為棕色至白色粉末,易溶於水。郭謙等(1998)用蔗渣培養的灰樹花菌絲體提取多糖,比用子實體提取多糖周期短,成本低。
1.工藝流程:固體培養(含灰樹花菌絲體)→沸水提取→過濾→濃縮→醇沈→離心→真空幹燥→稱重。
2.正交設計選取加水次數、提取時間、濃度比重、醇沈濃度四個因素作為考察因素,取三個水平(表4-8)進行L9(34)正交試驗,選取醇沈率作為考察指標,篩選出最佳工藝條件,菌絲體每次用量為100g。
表4-8實驗因素水平
3.結果在所選的三個水平上,加水量(因子A)對多糖得率有顯著影響,醇沈濃度(因子D)對多糖得率有顯著影響,提取時間(因子B)和濃縮倍數(因子C)對多糖得率影響較小。但對於提取時間(因素B),要選擇適合生產工藝的提取時間,而對於濃度比重(因素C),雖然是四個因素中最不顯著的因素,但在醇沈過程中,為了達到應有的醇沈濃度,乙醇的用量會隨著濃度比重的降低而急劇增加。因此,在生產工藝允許的前提下,應選擇較高的濃縮比例(表4-9)。
4.結論根據正交設計的實驗結果,確定灰樹花菌絲體多糖的最佳提取參數為:加水量為25倍,根據初步實驗結果,加水量為3∶2∶4;醇沈濃度為80%;濃度比重為1.035;提取時間可以從6、8和10小時這三個參數中選擇。壹般情況下,應選擇較短的提取時間,這樣可以節約能源,縮短工藝周期。根據初步實驗結果,提取時間比為1: 2: 3。
表4-9 L9(34)正交設計試驗數據