在生產和育種過程中,由於自然環境條件下不確定因素的作用,壹些西瓜材料往往會產生天然的基因突變,表現出特定的性狀,具有重要的研究和利用價值,成為西瓜種質資源創新的壹種寶貴途徑。比如國內的無叉西瓜、葉西瓜大葉紅、西瓜G17AB雄性不育兩用系、西瓜子葉失綠致死基因載體等等都是自然突變獲得的。
(二)混合創新
將兩種或兩種以上具有不同優良性狀的種質雜交,從分離的後代中逐代選育出綜合性狀優良的新品種或新種質,是常規品種選育的主要途徑。選擇壹些常見的常規西瓜品種,如:
小貍虎×徐大河-早花
棗花×華東24(♀)-米龍100×蜜寶-米龍104,米龍105。
棗花×紅梅(♀)-中宇1×青峰-邊良1
棗花×核桃圖案——鄭州2號×興城紅——鄭州3號×中育6號——洪詩1和2號
慶豐×米寶-中裕2號×毛巾條-中裕9號
毛巾條×久必利——中宇5號×中宇6號——中宇10
20世紀80年代以來,隨著雜交西瓜的興起,這種育種方法逐漸成為西瓜種質創新的主要途徑。
肖光輝等(1998)報道通過常規雜交轉育,將野生西瓜對枯萎病的抗性轉育到栽培西瓜上,在病圃經過7代自凈和抗性選擇,選育出4個抗性材料。苗期接種鑒定和感病土壤自然接種鑒定結果表明,4份入選材料中,2份高抗西瓜枯萎病,2份中抗,均高抗炭疽病。
(3)突變創新
包括化學突變和物理突變,主要表現在以下幾個方面:
化學誘變。
秋水仙素是誘導西瓜四倍體最典型的方法,誘變方法也在不斷改進。譚等(1993)通過剝離生長點外的幼葉,進行秋水仙堿落芽,誘導出四倍體西瓜,突變株率可提高到50% ~ 60%。方超等人(1996)以幼胚葉組織為外植體,用0.05%秋水仙堿溶液濃度在離體條件下誘導西瓜四倍體。突變率高達50% ~ 60%。馬國斌等(2002)認為,利用西瓜莖尖離體誘導四倍體的最佳途徑是8天左右的莖尖,誘變培養基應保持較低的細胞分裂素濃度和0.1%秋水仙素濃度24 ~ 48小時。
2.60鈷γ輻射
黃學森等(1995)用60Co γ射線(劑量376Gy,劑量率0.94 ~ 1.98Gy/min)輻照中育1號種子,獲得1抗枯萎病突變體材料和1無分枝突變體材料。
王恒偉等(2003)用60Co γ射線處理118西瓜幹種子,經過7代連續系統選育和鑒定,育成了新的突變系C68-42-10-9-23-73-82。該突變系具有中晚熟、植株生長勢強、抗枯萎病、果實圓形、淺綠色背景、中寬深綠色帶、果形指數1.01、平均單果重6.4公斤、果肉粉紅色、中心含糖量10.8%、耐貯運、種子大的特點
王明、馬克奇等人(1988)用60Co γ射線反復輻照原易位系徐大河等幾個優良品系的幹種子,進壹步提高其不育性,育成了壹批雜合易位少籽西瓜新品種。單瓜種子產量比普通二倍體降低50% ~ 80%,種子數最少的單瓜只含十幾粒到幾十粒種子。小太郎淺井和吳金義(1987,1993)用不同劑量的60Co γ射線輻照二倍體西瓜的幹種子和花粉後代。結果,在所有劑量下均發生染色體易位,並選擇易位純合子,培育出華芝A雄性不育系和少籽西瓜弘毅1和5號。
3.質子束輻射
孫遜等(2002)研究了不同能量(4,6,8mev)和劑量(25,50,100°C)的質子束輻照西瓜種子的致突變性,發現質子輻照可誘發異常有絲分裂行為和染色體結構變異——微核、染色體橋、染色體斷片等。隨著質子束能量和劑量的增加,染色體畸變細胞率增加。質子束還能引起雌花節位降低,果實早熟,果肉品質提高。同時篩選出兩個有價值的突變材料。
4.太空育種
小芳中學(2002)利用衛星搭載誘變技術處理西瓜幹種子,通過空間輻射和微重力雙重作用引起的遺傳變異,培育出新的品系和品種。實驗表明,太空處理的種子在當代種植中基本保持不變,但F2代後開始出現不同程度的返祖現象,染色體加倍,果實增大,品質改善,抗性增強等變異。在攜帶的5份材料中,高橋4號變異最明顯,果實大小比原來增加了20%,培育出了西瓜雜交新品種衛星2號(高橋4號×平5 ♀)。此外,崔彥嶺等(2004)育成了邢航1 ~ 3等幾個雜交西瓜新品種。
(D)生物技術創新1。單倍體培養
中國早就有西瓜單倍體培養成功的報道。如薛光榮等人(1988)分別用瓊蘇和周誌紅的花藥誘導培育植株。誘導的關鍵是選擇單核期小孢子發育時的芽(芽橫徑5mm左右,花冠明顯突出,花藥膨大,質地堅硬易脫落),在脫分化培養基上必須從花藥間隙分化出致密的愈傷組織。但是後來沒有成功的申請報告。
魏瑩(1999)以MS為基本培養基,添加NAA、6-BA和KT,觀察了西瓜花藥組織在4℃和10℃處理24h和72h的效果及花藥愈傷組織的形成。結果表明,處理後的花藥在早期褐化後2個月開始形成愈傷組織。其中,西農8號在4℃處理72h後,愈傷組織誘導率高達35.065438±0%。NAA對花藥愈傷組織的形成起主要作用,但不同基因型花藥的抗凍性存在壹定差異。
嶽薇等(2005)以10西瓜品種的雜種後代F1的花藥為研究材料,從基因型與激素作用的關系方面研究了花藥愈傷組織的誘導。結果表明,適宜的基因型是花藥誘導培養成功的關鍵因素。不同基因型對激素變化的敏感性不同,最適培養基也不同。
2.外源DNA的直接導入
根據導入方式的不同,可以分為以下幾類:
(1)花粉管導入李濤等(1996)將黑籽南瓜的DNA導入受體西瓜的早花品種中,希望獲得早熟抗寒的西瓜新品系。RAPD分析表明,突變後代產生了分子量約為2kb的DNA片段OPY02/2000。
王國平等(2003)利用通過花粉管通道直接將西瓜導入活體植株的技術,將攜帶外源幾丁質酶基因的質粒DNA施加到授粉的柱頭上,使其沿著花粉管通道進入生殖細胞,獲得轉化種子。用除草劑Basta篩選轉化的T1代植株,並通過PCR擴增獲得轉化植株。通過田間自然發病和人工接種鑒定出3個抗枯萎病菌株。結果表明,幾丁質酶對西瓜枯萎病有壹定的抑制作用。所采用的基因是來自水稻的幾丁質酶基因(Chill ),其構建在Ti質粒載體pCAMBar上。Chi11,宿主菌LBA4404,幾丁質酶基因片段大小為111kb,該質粒還含有BAR(抗除草劑)基因作為轉基因植物的篩選標記。
肖光輝等(1999)用DNA胚浸法將供體葫蘆總DNA導入西瓜,在D1代得到壹個突變體,變異率為0.32%。D2代突變株功能葉過氧化物酶同工酶譜帶增多,供體植株出現譜帶。與受體相比,D2代突變體植株部分染色體的臂長、臂比和帶型發生明顯變化,22.7%的果實果皮顏色由深綠色變為白色或白皮綠色,與供體葫蘆的果皮顏色接近,365,438+0.0%的果形發生變化。初步認為西瓜性狀的變異是導入供體葫蘆DNA的結果。在D3代病圃中篩選出的D3-1、D3-2、D3-3、D3-4和D3-5材料性狀穩定,在病圃中表現出較強的抗枯萎病性。幼苗接種鑒定結果表明,D3-1和D3。
(2)子房註射法王浩波等(2001)用子房註射法將南瓜總DNA導入西瓜。經過病圃田間篩選和第6代自凈,獲得5份穩定的西瓜種質材料,田間抗枯萎病能力顯著提高,其中3個品系達到高抗水平。
(3)基因轟擊(基因槍轟擊法)任等(2002)以西瓜頂芽為轉化受體,將質粒pBI121 DNA導入西瓜,旨在建立壹個基因槍介導的西瓜遺傳轉化體系。結果表明,預培養時間和轟擊次數對轉化率有顯著影響,而擴散室類型和甘露醇質量濃度對轉化率無顯著影響。通過檢測GUS基因表達產物,Kanr(抗卡那黴素)植株的轉化率為33.3%。
3.基因的遺傳轉化
隨著基因克隆技術的不斷發展,近年來成功克隆的目的基因數量不斷增加,推動了西瓜遺傳轉化的研究。
王春霞等(1997)以2日齡西瓜無菌苗的子葉為外植體,用銅綠假單胞菌培養,建立了根癌農桿菌介導的西瓜子葉遺傳轉化體系。所用的銅綠假單胞菌含有NPT-ⅱ基因、番茄ACC合酶及其反義基因的質粒。Southern-blot分析表明NPT-ⅱ基因已整合到西瓜基因組中,乙烯釋放指數表明轉化的ACC合酶正義和反義基因均有不同程度的表達。
王慧(2000)的研究表明,西瓜子葉外植體可以被含有雙元載體pBPMWMV的根癌農桿菌感染,該載體含有用於選擇kanr轉基因西瓜植株的NPT-ⅱ基因和WMV-2 CP基因。NPT-ⅱ酶活性檢測、DNA斑點雜交和Southern雜交結果表明,外源WMV-2 CP基因已導入西瓜細胞。鐘等(2003)的進壹步研究表明,通過自交結合PCR檢測,2 CP基因在第壹代自交植株中的分離比例為3: 1。經過四代篩選和鑒定,從T7、T11和T322三個獨立轉化子的後代中篩選出八個轉基因純合系,其性狀壹致。Western-blot分析表明,RT7-1、R4T11-3和R4T32-7三個不同的菌株能夠表達和產生外殼蛋白。轉基因純合品系WMV-2感染後的抗病毒試驗表明,與非轉基因對照相比,轉基因品系可延遲發病時間,降低發病程度。轉基因株系R4T32-7也表現出對WMV-2的高抗性。
陳崇順等(2002)利用尖孢鐮刀菌孢子和細胞壁碎片的混合溶液誘導豇豆幼苗表達特異性幾丁質酶,純化了特異性幾丁質酶,測定了其部分氨基酸序列,成功克隆了對尖孢鐮刀菌等病原真菌具有高抗性的特異性酶的編碼基因,並與pBI121重組成功構建了幾丁質酶基因的植物表達載體。
張自忠等(2005)構建了含有番茄幾丁質酶基因(chi3)和B-1,3-葡聚糖酶基因(GLu-AC)的雙價植物表達載體。以西瓜子葉塊為外植體,通過農桿菌介導法將chi3和Glu-Ac同時導入西瓜品種豫1。PCR、Southern-blot和RT-PCR檢測表明,外源基因已成功整合到西瓜基因組中,並在轉錄水平表達。用尖孢鐮刀菌離體檢測轉基因植物的抗病性。結果表明,轉基因植株對枯萎病的抗性有不同程度的增強。
牛勝鳥等(2005)利用西瓜花葉病毒(WMV)外殼蛋白基因、西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)復制酶基因和黃瓜花葉病毒(CMV)復制酶基因構建了三價植物表達載體,並通過根癌農桿菌介導的西瓜子葉外植體轉化獲得了再生植株。通過PCR和Southern-blot檢測,證明目的基因已成功導入西瓜植株,並能在後代植株中遺傳,轉化效率約為65438±0.7%。在溫室和田間對T2和T3轉基因品系進行了病毒接種試驗和抗病性篩選鑒定。轉基因西瓜品系表現出不同的類型,如易感性、抗病性、免疫力和癥狀恢復。其中,BH1-7品系T3植株對ZYMV和WMV的抗病性普遍達到中等水平,並保持了受體西瓜品系原有的優良農藝性狀。