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瓊脂糖凝膠電泳常見的問題有哪些?

瓊脂糖凝膠電泳是壹種以瓊脂或瓊脂糖為支持介質的電泳方法。對於分子量較大的樣品,如大分子核酸、病毒等。大孔徑的瓊脂糖凝膠壹般可用於電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳常見的問題有哪些?

DNA條帶模糊

DNA降解:瓊脂糖凝膠電泳試驗應避免核酸酶汙染。

舊電泳緩沖液:電泳緩沖液多次使用後,離子強度下降,PH值升高,緩沖能力減弱,影響電泳實驗。建議經常更換電泳緩沖液。

所用的電泳條件不合適:電壓不應超過20V/cm,溫度

DNA上升過多:凝膠中的DNA量應減少。

DNA樣品中過量的鹽含量:電泳前用乙醇沈澱除去過量的鹽。

蛋白質汙染:在電泳前用酚萃取除去蛋白質。

不規則DNA帶遷移

λ/hind ⅲ片段cos位點的復性:DNA5在電泳前65℃加熱5分鐘,然後冰上冷卻5分鐘。

電泳條件不合適:電泳電壓不超過20v/cm;溫度< 30℃;經常更換電泳緩沖液。

DNA變性:用20mM NaCI緩沖液稀釋DNA,電泳前不加熱。

DNA帶很弱或沒有

DNA樣本量不足:增加DNA樣本量;聚丙烯酰胺凝膠電泳的靈敏度略高於瓊脂糖凝膠電泳,可適當減少上樣量。

DNA降解:避免核酸酶汙染的危險

DNA出膠:縮短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度。

對於EB染色的DNA,使用的光源不合適:使用短波長(254mm)紫外光源。

DNA帶缺失

凝膠外的小DNA帶:縮短電泳時間,降低電壓,提高凝膠濃度。

分子大小相近的DNA條帶難以區分:增加電泳時間,批準正確的凝膠濃度。

DNA變性:電泳前不要高溫加熱NDA鏈,用20mM NacI緩沖液稀釋DNA。

DNA鏈很長,常規凝膠電泳不適用:脈沖凝膠電泳分析。

綜上所述,在瓊脂糖凝膠電泳實驗中要註意以下幾點:

1.在準備系統時,最關鍵的試劑必須確保它們仍然有效或未被汙染:引物、酶和超純水。妳最好自己把這些東西收好,寫上個人名字收好,還有記得在冰盒上系上橡皮筋,這樣就不會因為別人在翻冰箱而碰妳的冰盒和所有試劑了。不然妳的試劑被汙染了,陰性對照瘋了找汙染源會很麻煩。而且在配置系統的時候要註意保持實驗區的清潔。可以提前使用酒精噴霧來固定空氣中的DNA,並且要壹直戴著手套,以免汙染系統。

2.pcr系統要準確,最好用別人做了很多的舊系統。

3.如果想得到漂亮的電泳圖,可以在PCR開始的時候倒凝膠(前提是妳的總PCR時間大概是1.5小時,1.5小時後妳還在實驗室)。),讓凝膠冷卻,這樣凝膠的樣孔會更規則,凝膠本身的孔徑也會更規則。如果要在第二天再次運行凝膠,請確保將PCR樣品保存在4℃下。第二天做的時候建議將膠水冷卻25分鐘左右。

4.瓊脂糖凝膠電泳上樣時建議用槍上樣,不僅速度快,而且上樣加入凝膠孔的速度也是壹樣的。當然槍的排列最好選擇進口槍頭,國產槍頭就算了。

5.無論電泳室頻率高低,我建議每次瓊脂糖凝膠電泳都要更換電泳液,避免出現“”形條帶。