Agrobacterium-MediatedTransformation of Fusarium oxysporum: An Efficient Tool for InsertionalMutagenesis and Gene Transfer (Mullins etal., 2001) 農桿菌介導的尖孢鐮刀菌的轉化
簡介
農桿菌介導的轉化（Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation (ATMT)）壹直被用在植物細胞的轉化實驗中，這篇文章以尖孢鐮刀菌為例，構建了4個雙載體系統，並且優化了ATMT操縱真菌基因，構造插入突變體的實驗條件。實驗發現轉化效率受真菌孢子和農桿菌***培養時期農桿菌數量的影響最為顯著。
材料與方法
真菌材料
F. oxysporum strain O-685，在22℃下連續12d熒光燈照射，並使用CLA培養基（康乃馨葉片水瓊脂培養基，康乃馨葉片幹燥，滅菌，撒在水瓊脂上。也可以用CMC或者綠豆培養基），誘導真菌分生孢子產生。用無菌水沖洗培養的菌落表面並用移液器收集，並用壹種濾布Miracloth(CalbiochemBehring, La Jolla, CA)過濾掉大壹些的菌絲體，獲得孢子懸浮液(1 ×106?conidia per ml)。
構建載體
所有的載體都是在pCAMBIA1300 (CAMBIA, Canberra,Australia)載體的基礎構建的。（結果表明基礎載體和改造的都可以在尖孢鐮刀菌中起作用。這篇文章中用的載體比以前研究用的pUR5750，14kb小了很多）
（1）pBHt1（8.4kb）載體：用BamHI和HindIII酶切pCSN44質粒，獲得1.4kb大小，攜帶潮黴素B抗性基因（hygromycinB resistance ( hph ) gene）和構巢曲黴 trpC 啟動子的插入片段。而基礎pCAMBIA1300載體則如圖箭頭所示，用XhoI和BstXI酶將這部分切除，接合（ligate）上述插入片段，最終得到pBHt1（8.4kb）載體。
（2）pDHt（7.1kb）載體：將基礎載體按照（1）的兩個酶作用後，得到的片段在沒有插入片段的情況下自我連結（self-ligate）。
（3）pBHt2（8.4kb）載體：與（1）類似，但是插入序列是從pCB1004質粒裏獲得的。
（4）pKHt（10.6kb）載體：2.2kb大小的片段包含ColE1復制起點（replicationof origin）和氯黴素抗性（ferringchloramphenicol resistance）基因。這段序列是通過特異性引物ECO-1和PST-1擴增pBCSK (Stratagene, La Jolla, CA)得到的。在pBHt2的基礎上，插入的位置是MCS（Themultiple cloning site，MCS包含EcoRI,SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI, 和HindIII等位點）。
轉化
（1）包含合適的雙載體的農桿菌 Agrobacteriumtumefaciens strain ?AGL-1在28℃，包含卡那黴素（kanamycin，50μg/ml）的 MM 培養基（Minimalmedium(g/L)：K2HP04, 2.05; KH2P04,1.45; NaCI, 0.15; MgSO4.7H20, 0.50; CaCI2.6H20,? 0.1; FeSO4.7H20, 0.0025;(NH4)2S04, 0.5）中生長2d。
（2）將農桿菌細胞在 IM 培養基（inductionmedium: MM salts, 40 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES), pH 5.3, 10mM glucose, 0.5% (w/v) glycerol, 200 ?M AS）中稀釋到OD600= 0.15，繼續培養6h。（結果顯示前培養時AS不是必需的）
（3）然後將農桿菌菌液與上述制備的孢子懸浮液1：1混合。200μl混合液平鋪在消化纖維素濾紙（nitrocellulosefilter）上，濾紙放在在***培養平板上，所用培養基和 IM 唯壹的差別是glucose含量為10 mM。25℃培養2d。
（4）濾紙轉移到含有hygromycinB (75 ?g/ml)，cefotaxime (200 ?M)和moxalactum (100 ?g/ml)的MM培養基。
（5）獲得的真菌轉化子分別獨立的轉移到24孔板裏，孔裏含有 CLA 和hygromycin B (75 ?g/ml)，培養至產孢。
（6）獨力轉化子產生的孢子在水中稀釋，塗布在含有hygromycin B (75 ?g/ml)的PDA上。獲得單孢菌落。並且通過多代無抗生素培養，隨後再次接種在含有抗生素培養基上的方法，檢測轉化的穩定性（文章結果是6代仍遺傳穩定）。
Transformation ofConiothyrium minitans, a parasite of Sclerotinia sclerotiorum, withAgrobacterium tumefaciens (Li et al.,2005) 通過農桿菌介導將盾殼黴轉入到核盤菌
這個文章同樣用到了農桿菌轉化，但是因為實驗真菌不同，這個文章在前壹篇的基礎上，更改了真菌培養溫度，時間；真菌孢子濃度（107?spores/ml）；孢子和農桿菌***培養時AS濃度400μM。以及壹系列抗生素的濃度都根據材料有所變化。
參考文獻
Li, M., Gong, X., Zheng, J.,Jiang, D., Fu, Y., and Hou, M. (2005) Transformation of Coniothyrium minitans,a parasite of Sclerotinia sclerotiorum, with Agrobacterium tumefaciens.? FEMS microbiology letters ? 243 : 323-329.
Mullins, E.D., Chen, X., Romaine,P., Raina, R., Geiser, D.M., and Kang, S. (2001) Agrobacterium-mediatedtransformation of Fusarium oxysporum: an efficient tool for insertionalmutagenesis and gene transfer.? Phytopathology 91 : 173-180.