雙雜交系統的建立得益於對真核生物調控的轉錄起始過程的了解。細胞起始基因的轉錄需要反式轉錄激活因子的參與。80年代的工作表明，轉錄激活因子在結構上是模塊化的，即這些因子往往由兩個或多個獨立的結構域組成，包括DNA結合結構域(BD)和轉錄激活結構域(AD)，它們是轉錄激活因子發揮功能所必需的。前者能識別DNA上的特定序列，定位受調控基因上遊的轉錄激活域。轉錄激活域可以與轉錄復合物的其他成分相互作用，啟動其調節的基因的轉錄。這兩個域不僅可以在它們的連接區域的適當部分被打開，而且具有它們自己的功能。此外，不同的兩個結構域可以被重建以在轉錄激活中發揮作用。酵母雙雜交系統利用雜合基因通過激活報告基因的表達來檢測蛋白質間的相互作用。雖然單獨的BD可以與啟動子結合，但它不能激活轉錄。但BD和AD與不同轉錄激活因子形成的雜合蛋白仍具有正常的激活轉錄的功能。例如，通過將酵母細胞的Gal4蛋白的BD與大腸桿菌的酸性激活結構域B42融合而獲得的雜合蛋白仍然可以與Gal4結合位點結合並激活轉錄。主要有兩種類型的載體:含有DNA結合結構域的載體；含有DNA激活域的載體。通常，編碼蛋白質的基因與透明轉錄調節子(如GAL4-bd、萊克薩-bd)的DNA結合結構域融合；另壹種蛋白質的基因與轉錄激活域融合(如GAL4-ad，VP16)。當構建上述兩類載體的融合基因時，測試蛋白基因和結構域基因必須在閱讀框內融合。融合基因在報告菌株中表達，表達產物只有位於細胞核內才能驅動報告基因的轉錄。例如，GAL4-bd有核定位序列，但GAL4-ad沒有。因此，應該在GAL4-ad的氨基端或羧基端克隆壹段SV40 T抗原作為核定位序列。目前常用的結合域基因有:gal 4(1-147)；萊克薩(大腸桿菌轉錄抑制劑)的DNA-bd編碼序列。常用的激活域基因是GAL4(768-881)和皰疹病毒的編碼序列VP16。
雙雜交系統的另壹個重要元素是報道菌株。報告菌株是指含有報告基因重組質粒的修飾宿主細胞。酵母細胞是最常用的。酵母雙雜交系統作為報告菌株有很多優點:< 1 >易於轉化和回收擴增的質粒。< 2 >具有可直接選擇的標記基因和特征報告基因。[3]酵母的內源性蛋白質不容易與來自哺乳動物的蛋白質結合。將激活域融合基因轉入表達結合域融合基因的酵母細胞系中，蛋白質之間的相互作用導致轉錄因子的重建和相鄰報告基因(如lacZ)的表達，從而可以分析蛋白質之間的結合。
酵母雙雜交系統能在體內測定蛋白質的結合，靈敏度高。主要原因如下:(1)使用高拷貝、強啟動子的表達載體過量表達雜合蛋白。②信號測量是在自然平衡濃度條件下進行的，但免疫沈澱等物理方法需要多次洗滌才能達到這個條件，降低了信號強度。③雜合蛋白之間的穩定性可通過激活域和結合域結合形成轉錄起始復合物而增強，轉錄起始復合物又與啟動子DNA結合，這種三元復合物使各組分的結合趨於穩定。mRNA產生多種穩定的酶來放大信號。同時，酵母表型、X-Gal和HIS3蛋白表達的檢測方法非常靈敏