901，leu2—3，112，ura3-52，his3-200，gal4A，gal8O~X，
Lys2:: 1u s-gallt-his3，gu s-gai2t t-
ADE2，ura3:: h吐1u s.h吐1t t.1acz)，YM187酵母。
細菌(NATQ，um3-52，his3-200，ade2-101，trpl-901，
leu2-3，112，g △，met，O△,URA3::GAL1U^s-
gal1t^t^·阿·萊斯，東北！, 1).I～bkt 7-p53是壹種編碼小鼠p53的卵。
白色(a.a.72-390)和gal 4 DNA BD(a . a . 1-147)融合。
蛋白質陽性對照質粒。Pcarrr7。t是編碼SV40的大t。
抗原(a.a.87-7o8)和gal 4 DNA . BD(a . a . 1-147)的融合。
融合蛋白的陽性對照質粒，上述菌株和質粒購自
克隆技術公司。JIVl109大腸桿菌菌株購自promega。
公司。
1.2試劑鮭魚精子載體DNA，YPD酵母培養物
medium SD minimum medium-dosupply-Leu
Dosupply，a leu/a Trp dosupply，a leu/Trp/his。
做補充，Ade//His//L~aTrp 130補充等。
都是從克隆技術公司購買的。硫酸腺嘌呤(腺嘌呤半硫。
Fate)是從Gibco購買的。PEG 3250購自適馬。DMSO購自。
阿姆雷斯科.硝酸纖維素膜購自Phamacia。X-Gal購買
自從BBI。QIAprep Miniprep試劑盒購自QIAGEN公司
其常規分子生物學試劑購自北京華美生物公司。
1.3 pGBKT7.ps3和t ~ alrr7.t質粒用2。
在mL LB液體培養基中擴增pGBKT7-p53和pGADT7-t
谷物。分別采用小規模堿裂解法7 (AIK法)和QtarREP。
通過Miniprep試劑盒(QIAGEN方法)提取質粒。紫外線成分
分光光度法測定0D260/280，計算質粒DNA含量。
1.4酵母雙雜交* *轉化實驗按照酵母操作手冊進行。
建議的轉換方法，取上述兩種方法的不同量。
質粒pGBKT7—053和pGADT7。T * *被轉化為AH109。
在酵母菌株中，轉化細胞按照1: 10，1: 100，1:
稀釋10003不同濃度，然後在SD/上塗抹100
在Trp//Leu平板上，在克隆生長後計數生長克隆的數量。
(cfu).計算* * *轉化效率:轉化效率cfu//。tgdna = cfu。
×懸浮細胞體積()×稀釋倍數/[鋪板體積()×
這裏的DNA量是指使用的DNA量。
質粒的量而不是所有質粒的總量)。
1.5酵母雙雜交序列轉化實驗取上述不同量。
將兩種方法提取的PGBKT7—053轉化到AH109酵母中。
菌株AH109 [PGBKT7-
53]，選擇新鮮AH109[pGBKT7-1直徑2-3伊朗。
P53]酵母單克隆4-8，接種於1 ml SD//Trp缺陷。
在液體培養基中，渦旋振蕩為65438±0米拉，完全打散了菌群。添加1
將IIll的菌液轉移到5O IIll的sD液體缺乏培養基中。將
PGADT7-T轉化為AH109[pGBKTT-53]，其他方法相同。
酵母操作手冊，按照1: 10，1: 100，1:
用三種不同濃度稀釋1000，然後在SD/I上塗抹100。
關於Trp/。leu平板，生長後計數克隆數。
(cfu).根據上面的公式計算轉換效率。
1.6聯合pGBKT~.p53和p53的酵母雙雜交交配試驗
將PGADTrT質粒分別轉化酵母菌株AH109和酵母菌株AH109。
YM187，在相應的SD缺陷型培養基平板上生長。
克隆後，分別選擇2-3 NL/N酵母單克隆* * *各壹株。
放置在壹個1 IIll分離器中，其中含有0.5ml ypda液體介質。
在心臟導管中，通過渦旋振動65438±0分鐘來完全破壞菌群，並且在3℃和200rpm (20-24小時)下進行培養過夜。100交配文化正在傳播
SD/Leu培養基平板，200個交配培養物分散在。
Sd/His//I ~ u/tw (tdo)中板。二倍體數目的檢測
目:將交配產物按三種不同濃度濃縮:1: 10，1: 100和1: 1000。
稀釋，然後取100鋪在SD/Trp/。低濃縮鈾板。戴昌
克隆後計數cfu。計算二倍體細胞數:cfu×懸液。
漂浮細胞體積(ta)×稀釋倍數/平板體積(ta)。
1.7地窖分析實驗a1
1.7 . 1.8-半乳糖苷酶AH109的定性分析和檢測
[pgbkt7-053+pgadt7-T]的8-半乳糖苷酶活性，選擇
酵母克隆(新鮮直徑為2-3 mm)用雙對角線交叉，平鋪在地板上。
在相應培養基平板上的滅菌硝酸纖維素膜上，3ocI=
倒置培養24小時。將薄膜在液氮中冷凍幾分鐘。
不要放10 s，30 s，1雨，2雨，30cI= 10 mill，放在浸液裏。
在z buffer/x . gal(100ml z buffer，0.27 ml f ≥ I巰基b。
酒精，1.67ml的20 mg/m ~ X-Ga1)濾紙上的溶液(zbufedx。
Gal溶液(最好是浸濕的濾紙)，放置在3OcI =
觀察，15雨時記錄壹次，此後每1 h記錄壹次。
時間。觀察不同條件下菌落的顏色變化，並在酵母下面劃線
陽性結果是菌落顏色在8小時內變藍。同時
液氮的無限凍結時間為65438±0min，處於不同的顯色溫度。
f在(25℃，30℃，37℃)時；-半乳糖苷酶活性。
1.7.28半乳糖苷酶定量分析AH109
[pgbkt7-053+pgadt7-T]的8-半乳糖苷酶活性與[pgbkt7-053]相同。
當時以AH109[pCL1]為陽性對照，AH 109 [PGBKT7-053]。
+pG~rr7-T]和AH109[pGBKT~+pGADT~-T]為空。
身體控制，AH109是陰性控制。AH109的稀釋[pCL1]
倍數為3，其他稀釋倍數為1。具體步驟參照酵母。
操作手冊。β半乳糖苷酶的計算單位為1000×OD∞/ ∞/
(t×V×ODao)，其中t為反應時間，v = 0.1毫升×稀釋。
釋放多個。