HRP標記抗體的方法:
根據酶的結構不同可采用不同的方法。對於制備HRP結合物,可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。?
戊二醛二步法原理:
戊二醛為壹種雙功能試劑,通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基***價結合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。
在不斷攪拌下,每升濾液中慢慢加入226克硫酸銨粉末(相當於0.40飽和度),大約在1~2小時內加完,置冷室中放置過夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出,下面渾濁液以3000轉/分離心15分鐘,棄沈澱,合並上清液。
再按每升上清液加258克硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌,當硫酸銨全部溶解後,置冷室過夜。次日,虹吸出上清液,沈澱部分在冰凍離心機中以13000轉/分離心20分鐘,棄去上清液,收集沈澱。
擴展資料:
1、?8mg辣根過氧化物酶放入1ml玻璃瓶,加入1ml雙蒸水溶解,液體呈棕色。
2、放入壹個磁力攪拌子,電磁攪拌同時逐滴緩緩加入新配制的NaIO40.2ml,室溫下繼續攪拌40min,液體呈現草綠色。
3、將全部溶液用滴管裝入反復用去離子水沖洗的透析袋中,4oC對1?mMpH4.4的NaAc透析過夜,中間換液3-4次,每次300ml,溶液最終呈淺棕色。
4、按照酶:抗體=1:1的比例準備抗體,抗體濃度不小於2mg/ml。
5、對0.01MNa2CO3透析過夜,中間換液3-4次。
6、將透析好的HRP溶液(淺棕色)裝入玻璃瓶,加入0.2MNa2CO3溶液將pH調整至9.0,混勻後立即加入透析好的抗體,邊加邊用電磁攪拌器攪拌。
7、MNa2CO3溶液將HRP/抗體混合物的pH調整至9.0(9-10之間就可以),室溫繼續攪拌3hr。
8、入新配制的硼氫化鈉溶液100ul,4oC放置2hr。
9、4oC,1×PBS中充分透析,每2hr換液壹次,***換4次。
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