組織分離法簡單易行，後代變異小，並能保留菌株的優良特性。這是生產中常用的菌種分離方法。種菇應選擇外形典型、大小適中、菇蓋表面鱗片少、色澤潔白、無病蟲害的，種菇應在雞腿菇桿狀生長後期或紡錘狀生長初期采摘。
母種培養基可以是PDA培養基，也可以使用以下配方:小麥600g，鮮子實體100g，葡萄糖20g，蛋白腖3g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂1g，硫酸鈣1g，瓊脂25g，水65438。母種培養基的生產工藝和無菌分離技術不再介紹，其他食用菌制種技術也不再介紹。
(2)原種生產
雞腿菇原種多為小麥種子，其制備方法為:將小麥種子浸泡24小時左右至小麥種子發白，用清水洗凈煮沸20-25分鐘，取出瀝幹的水，加入1%石膏粉和20%粉碎的小麥稭稈發酵料，然後裝瓶，無菌接種培養。該配方菌絲生長旺盛，速度快，750ml菌種瓶在25℃12-15天即可滿瓶。
(3)栽培品種的生產
雞腿菇的培養基大多是用棉籽殼和麥稭發酵料制成的。配方如下:發酵麥稭和牛糞33%，麩皮10%，棉籽殼50%，玉米粉5%，石灰2%。首先在粉碎的麥稭中加入20%-30%的牛糞和2%的石膏，堆積發酵5-6天，然後加入其他原料，發酵48小時，裝袋，無菌接種，培養。該配方與只使用發酵料和只使用棉籽殼相比，具有發酵速度快，菌絲強壯的優點。