細胞溶解:首先,溶解含有靶蛋白的細胞或組織樣品,釋放細胞內蛋白。這通常涉及使用細胞裂解緩沖液,其中含有蛋白質裂解劑和蛋白酶抑制劑,以保護蛋白質的完整性。
免疫沈澱:接下來,針對目標蛋白質的特定抗體與樣品中的蛋白質結合。這可以通過預先在蛋白A/G瓊脂糖珠或蛋白A/G瓊脂糖珠上包被抗體來實現。抗體與靶蛋白結合形成免疫復合物。
洗滌:將樣品通過洗滌步驟,以去除蛋白質和其他未被特異性結合的雜質。洗滌緩沖液的成分可以根據實驗要求進行調整,壹般包括鹽溶液、去汙劑和蛋白酶抑制劑。
洗脫:用洗脫緩沖液從蛋白A/G瓊脂糖珠或瓊脂糖珠上洗脫免疫復合物。洗脫緩沖液通常含有高濃度的鹽溶液或特定的蛋白解離劑,以破壞抗體與靶蛋白的結合。
分析:洗脫樣本包含與目標蛋白質相互作用的其他蛋白質。這些樣品通常通過蛋白質印跡和質譜進壹步分析,以確定* * *沈澱的蛋白質。
通過* * *沈澱法,可以鑒定與靶蛋白相互作用的蛋白質,並進壹步研究它們的細胞內功能和調控機制。