酵母雙雜交系統的最主要的應用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。酵母雙雜交系統檢測蛋白之間的相互作用具有以下優點： ⑴ 作用信號是在融合基因表達後， 在細胞內重建轉錄因子的作用而給出的， 省去了純化蛋白質的繁瑣步驟。⑵ 檢測在活細胞內進行， 可以在壹定程度上代表細胞內的真實情況。⑶ 檢測的結果可以是基因表達產物的積累效應， 因而可檢測存在於蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。⑷酵母雙雜交系統可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構建cDNA文庫， 能分析細胞漿、細胞核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。例如已報道成功分析了RAP1與RIF1ii、P21cip1與CDK2iii、p16與CDK4iv等之間的相互作用。