（1）轉染後24-48
h
可收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min,
細胞裂解液於4°C，
最大轉速離心30
min後取上清；
（2）取少量裂解液以備Western
blot分析，剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；
（3）取10μl
protein
A
瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3
次，每次3,000
rpm離心3
min；
（4）將預處理過的10μl
protein
A
瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein
A瓊脂糖珠耦聯；
（5）免疫沈澱反應後，在4°C
以3,000
rpm
速度離心3
min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次；最後加入15μl的2×SDS
上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；
（6）SDS-PAGE,
Western
blotting或質譜儀分析。
註意的問題：
（1）細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質－蛋白質相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton
X-100)。每種細胞的裂解條件是不壹樣的，通過經驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2%SDS)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。
（2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體***同使用。
（3）使用對照抗體：