DMEM-ADMEM-B膠原酶雄性大鼠
試劑和試劑盒
KRBH緩沖器KRBH-A緩沖器
儀器和耗材
培養皿錐形離心管聚丙烯管低密度聚丙烯瓶尼龍過濾嘴解剖剪佩裏鑷子塑料盒幹草切割器移液管
實驗步驟
首先，切除附睪脂肪墊
1.當充入70%的二氧化碳時？還有30%的氧氣。大鼠(Sprague-Dawley雄性大鼠:145~170 g，CD系列)在混合氣體的塑料盒中麻醉。
2.用鍘草機斷頭出血。
3.將老鼠浸泡在70%的乙醇中壹會兒。
4.盡量在無菌條件下取出附睪脂肪墊。
(a)用手術刀切開下腹部皮膚，露出腹膜。
(b)用另壹把解剖剪刀切開腹膜，然後用Perry鑷將睪丸向上拉。
(c)切開附睪脂肪墊，註意保存血管。
5.將組織轉移到培養實驗室。
消化並洗滌來自脂肪細胞的膠原酶(向2 ml KRBH緩沖液中加入20 mg/ml膠原酶，然後用0.22微米過濾器過濾)。
6.將4 g脂肪墊(相當於8個附睪脂肪墊)放入4 ml KRBH緩沖液(Krebs-Ringer溶液，pH 7.4)，加入10 mmol/L NaHCO3、30 mmol/L HEPES(適馬)、200 nmol/L腺苷(Boche)和1%。配制1 L KRBH緩沖液時，7 g NaCl，0.55 g KH2PO4，0.25 g MgSO4？7H2O，0.84 g NaHCO3，0.11 g CaCl2，7.15 g HEPES，10 g BSA，1 ml 200 μmol/L腺苷，加超純水至1 L，然後，按100 ml包裝。使用前，將其加熱至37°C，並將pH值調節至7.4。)(37℃)，裝在30毫升低密度聚丙烯瓶中。
7.將脂肪墊切成直徑約2 mm的組織塊。
8.將組織塊放入瓶中，然後加入1 ml膠原酶溶液。在37°C水浴振蕩器中培養約65438±0小時，直到細胞混合物形成乳脂狀粘稠液體。
9.膠原酶消化後，向瓶中加入4 ml KRBH緩沖液(37°C)。
10.通過攪拌混合瓶中的細胞，然後將細胞輕輕過濾到帶有孔徑為250微米的尼龍篩網的50毫升錐形離心管中(置於支持物或漏鬥中)。
11.向離心管中加入30毫升KRBH緩沖液(37°C ),清洗細胞。用臺式離心機短時間離心(200 g)，然後用吸管吸出上清液。註意脂肪細胞漂浮在水性緩沖液的上面。
12.通過加入40 ml KRBH緩沖液洗滌細胞，離心並去除上清液。重復此步驟1次。
13.使用40毫升DMEM-A (DMEM，pH 7.4)，加入25毫摩爾/升葡萄糖，2毫摩爾/升谷氨酰胺，200毫摩爾/升(R)-N6-(L-甲基-2-苯基乙基)腺苷(PIA，適馬)和6544。根據100 ml進行分裝，加熱至37°C(37°C)，並在使用前清洗電池兩次。
14.用大約40%的細胞因子DMEM-A懸浮漂浮的細胞
第二，脂肪細胞的原代培養
15.用200 μl大口徑移液管將2ml 40% cyto crit DMEM-A懸浮液轉移到60 mm培養皿中。
16.將培養皿放在37℃和5% CO2的潮濕培養箱中。在1.5 h的條件下
17.向培養皿中加入5毫升DMEM-B (DMEM-A，7%牛血清白蛋白)。
此時應進行葡萄糖攝取試驗[Quom 1998]檢查細胞活力。
-
中山醫科大學學報(Acadjsum)，2001，22 (6): 443 ~ 446443。
人前脂肪細胞的原代培養
1，2，李？嚴2，楊1，匡1。
(中山醫科大學？1.孫逸仙紀念醫院婦產科，2。廣東廣州生物系？510120)
挑？想要:？目的建立人前脂肪細胞的原代培養方法，為進壹步研究人脂肪組織增生的生物學特性奠定基礎。？方法選取成人腹部脂肪組織，采用原代消化細胞培養法培養棱形細胞。同時取皮膚組織培養作為對照。？結果培養的棱形細胞成分均勻，增殖旺盛，分化率高。通過形態學動態變化觀察、生長曲線和油紅O脂肪染色提取法，證明其為活躍的前脂肪細胞，並在體外再現了其增殖的全過程。？結論成熟脂肪組織中存在能夠分化成熟並產生脂肪的前脂肪細胞。由於脂肪細胞是胰島素作用的經典靶細胞之壹，本實驗為進壹步研究肥胖和胰島素抵抗相關疾病如多囊卵巢綜合征奠定了基礎。
關鍵詞:前脂肪細胞；細胞培養；脂肪組織
中國圖書館分類號:Q254，R711.75？文件識別碼:a？文章編號:1000-257 x(2001)06-0443-04。
primarycultureofhumanpredipocyte
王鑄？陳1，？中2，李炎2，陽東？zi1，狂劍？quan1
(1.中山大學婦產科。紀念醫院，2。生物系，
SunYat？中國廣州醫學科學院大學，510120)
摘要:？目的建立原代人前脂肪細胞培養方法，以更好地了解人前脂肪細胞的特性。？方法采用原代細胞培養，成纖維細胞？就像培養的細胞壹樣。結果細胞高度均壹、增殖、分化率高。他們的動態形態變化，生長曲線，提取stainedintracytopsilclipid with oil redo，all verified theirpreipocyteidentity。在受控條件下，preipocytesreplayedtherhyperplasiaprocessinvitro。？結論在成人脂肪沈積組織中，存在前脂肪細胞和分化脂肪細胞。由於脂肪細胞sonekindofclassictargetcellstoinsulin，這項研究laidthebasisforfur？therpropingintoobesityandinsulinresistant diseases ssuchasycysticovarysyndrome。
關鍵詞:前脂肪細胞；細胞培養；脂肪組織
脂肪細胞是胰島素作用的經典靶細胞之壹，並且
肥胖和胰島素抵抗相關疾病，如多囊卵巢綜合征
研究密切相關，近年來在婦科內分泌領域受到較多關註。
看吧。前脂肪細胞是壹類具有增殖和分化成脂肪細胞的細胞。
趨化能力的特化前體細胞，它的存在和功能繼續。
在人類生活中，我們已經從人類脂肪組織中培養出前脂肪細胞。
細胞為進壹步研究奠定了基礎。
收到日期:2001-04-23
基金項目:廣東省衛生廳科研基金資助(2001189)
,;1?材料和方法1.1？從2000年9月到2006年9月5438+0，1，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438，65438剖腹手術中獲取皮下脂肪組織和皮膚組織。
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1.2?試驗材料
1.2.1?主要測試用品和化學試劑？DMEM/F？12中等(1！1)、無支原體胎牛血清、A型膠原酶、Hepes、人轉鐵蛋白、青黴素、鏈黴素均購自GIBCO公司。生物素、泛酸、氫化可的松、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、3？異丁基？1?甲基黃嘌呤是SIGMA公司的產品。牛血清白蛋白購自羅氏公司。實驗所需的無機試劑購自廣州醫藥公司化學檢測批發部，均為分析純試劑。培養瓶購自KORNING公司。
1.2.2?培養基和主要試劑的準備？培養基A[1]中山醫科大學學報(Acadjsum)，2001，22 (6)培養基A制成細胞懸液，接種於25cm2培養瓶中，密度為3？65，438+00細胞在體積分數為5%的37# CO2培養箱中孵育65，438+06h。之後，PBS輕輕洗去培養瓶中未粘附的物質，用培養基C誘導並維持脂肪細胞分化。3天後換成B培養基，之後每隔2 ~ 3天換成B培養基。1.3.2?人前脂肪細胞和皮膚成纖維細胞的組織學染色？把蓋玻片切成0？5cm？1?0cm大小，接種時置於培養瓶中，待細胞貼壁後每隔2、3天取出培養瓶進行染色。將脂肪細胞朝上的壹側浸入體積分數中。
在編號為10%甲醛的等滲鹽緩沖液中固定10min，然後放入PBS緩沖液中，輕輕沖洗壹會兒，直立使殘留的水流到邊緣，用吸水紙吸幹。稍加幹燥後，人類前脂肪細胞由蘇丹紅%制成？& amp細胞核滴染和邁爾蘇木精雙染，甘油明膠密封；皮膚成纖維細胞蘇木精伊紅染色，脫水透明，中性樹脂密封，光鏡觀察，拍照保存結果。
1.3.3?細胞生長曲線的繪制？將細胞懸液接種於24個培養瓶中，隨機分成8組，每組3瓶。每2天檢測壹組中每瓶的細胞總數，取3瓶的平均值，以此結束第八組。細胞計數法參考醫學細胞生物學實驗[3]。
1.3.4?油紅O染色提取法測定細胞內脂肪含量？接種方法同1.3.3。根據Ramirez[2]4:取DMEM/F？5g 12培養粉，加入胎牛血清使其體積分數為10%，三重蒸餾水體積為500mL中號b:按照說明服用DMEM/F？12培養粉10g，終濃度15mmol/lnahco3和15mmol/lhep？es，33？Mol/L泛酸，17？Mol/L人轉鐵蛋白，100000U/L青黴素，0？1g/L鏈黴素，100nmol/L氫化可的松，60nmol/L胰島素，0？2nmol/LT3，三重蒸餾水定容至1000ml；培養基c:取200mL培養基a，加入3？異丁基？1?甲基黃嘌呤，使其最終濃度為0？25 mmol/L；消化液:稱取膠原酶(？150mg型，牛血清白蛋白2g，0？0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)至100ml；紅細胞裂解緩沖液:稱取適量NH4Cl、K2HPO4和EDTA，使其終濃度為154mmol/L，5？7mmol/L和0？1mmol/L，三重蒸餾水
將體積固定為250毫升。以上溶液均已調至pH 7？4~7?6,0?22?m微孔濾膜正壓過濾除菌，包裝後-30#保存。油紅o工作液[2]等。培養物用體積分數為10%甲醛的等滲鹽水緩沖液固定1h，然後用蒸餾水沖洗。吸取10mL油紅O工作液，將培養面朝下，2小時後將瓶中的油紅O倒出。
用工作溶液和蒸餾水沖洗培養瓶數次，直至其完全漂浮。將染色後的培養瓶放入32#培養箱中蒸發瓶內水分，然後加入1mL異丙醇，立即用吸管吸去萃取後的染料溶液，用HITACHIG2000分光光度計在波長510nm處測量吸光度。:體重4？將2g油紅O溶解在1200mL異丙醇中，並在室溫下靜置過夜。用分析濾紙過濾後收集濾液，加入900mL三重蒸餾水。再次在4號靜置過夜後，可在室溫下保存備用。1.2.3?樂器？設備？CO2培養箱、倒置顯微鏡等。1.3?方？法律
1.3.1?人前脂肪細胞和皮膚成纖維細胞的原代培養[1]？手術過程中，約60g脂肪組織和約0？5cm？3cm用於成纖維細胞培養作為對照。PBS洗滌，分離去除脂肪組織中可見的纖維成分和血管，皮膚組織需要去除表皮和皮下脂肪，切成2mm左右？2mm小塊，加入消化液，置於體積分數為5%的37# CO2培養箱中消化。15h後，200？g短時間離心去除漂浮的脂肪細胞和培養基，將沈澱的細胞用紅細胞裂解緩沖液再次制備成細胞懸液，37#孵育10min去除汙染的紅細胞，150？2?打結？2.1?原代培養人前脂肪細胞和皮膚成纖維細胞的形態學觀察:細胞貼壁後起初呈小圓形，核漿比大(圖1？1)，4天後觀察到細胞逐漸呈梭形，7天左右棱形細胞大量增生，在培養瓶底部面積達到1/2後開始堆積脂肪顆粒(圖1？2)。第9天，觀察到細胞逐漸由棱形變為橢圓形或圓形(圖1？3)、堆積著脂肪顆粒
第六期？王珠臣等。人類前脂肪細胞445脂肪細胞的原代培養(圖1？4)。體外培養的脂肪細胞體積大，細胞膜薄，膜輪廓不光滑、不均勻、有皺褶。細胞質中有大量圓形脂滴，大小不壹，呈散在狀。也有大量小脂滴結合成大脂滴的情況，細胞核仍在邊緣。同時，培養的皮膚成纖維細胞增殖速度相似，但始終呈長棱形，無脂滴堆積(圖2？1，圖二？2)。
2.2?人前脂肪細胞和皮膚成纖維細胞的生長曲線
從生長曲線可以看到人前脂肪細胞(圖3？1)和皮膚成纖維細胞(圖3？2)的倍增時間分別為60h和55h。
。3?拜托了。3.1上？人前脂肪細胞培養在婦科內分泌學中的研究意義:脂肪細胞是脂肪組織的重要組成部分，是其功能的主體。當代研究認為，脂肪組織中的脂肪細胞非常活躍，細胞的數量、形態和細胞內脂肪含量處於動態變化中，並終生保持。肥胖被認為是脂肪細胞不受控制的增殖和分化的結果。目前，胖
肥胖已經成為與婦科內分泌密切相關的疾病。肥胖可產生胰島素抵抗/高胰島素血癥，這是許多臨床疾病或癥狀的相同危險信號，尤其是常見的內分泌和代謝疾病如糖尿病、高血壓和動脈粥樣硬化，因此近年來成為許多醫學學科同樣感興趣的研究熱點。尤其是近年來，研究發現
圖3.1？人前脂肪細胞生長曲線
圖3.1？人前脂肪細胞生長曲線
培養胰島素抵抗/高胰島素血癥也與育齡婦女高雄激素血癥和無排卵有關。多囊卵巢綜合征，
約5%~10%的育齡婦女患有此病，常伴有肥胖，病因不明。目前認為多囊卵巢綜合征是壹種以胰島素抵抗為特征的內分泌代謝疾病，繼發於胰島素抵抗的高胰島素血癥在引起高雄激素血癥和不孕的體征中起重要作用[4]。脂肪細胞充當胰島素抑制劑。
圖3.2？人皮膚成纖維細胞的生長曲線
圖3.2？人皮膚纖維化生長曲線是敏感的靶細胞之壹，因此研究其潛在的胰島素抵抗機制具有特殊的臨床意義。前脂肪細胞體外培養
全面了解脂肪組織發生和增殖的全過程，直接觀察各種因素對這壹過程的調控並研究其機制，是研究脂肪組織的理想模型。雖然國外已經建立了小鼠前脂肪細胞來源的細胞系，如3T3？L1、3T3？F442A，ob17系列等。，但到目前為止，還沒有建立人前脂肪細胞株[5]，限制了進壹步的研究。
3.2?體外培養人前脂肪細胞的生物學特性
目前國內外前脂肪細胞體外培養體系有兩種，壹種是來源於血管基質成分細胞(stromalvas？分子分數(SVF)，這是壹個典型的前脂肪細胞。Van等人[6]系統研究了SVF，形成了完整的前脂肪細胞理論。他們用膠原酶處理切割的脂肪組織，然後離心組織懸液，其中沈澱基質血管成分是SVF，並培養SVF。與培養的成纖維細胞相比，兩種培養物增殖速度相同，倍增時間約為55小時。在顯微鏡下對比細胞，發現起初2.3？前脂肪細胞和皮膚成纖維細胞生長過程中細胞內脂肪含量的變化。前脂肪細胞中的脂肪含量在培養9天後迅速增加，在大約16d時達到峰值，而皮膚成纖維細胞中僅有少量脂肪堆積(圖4)。
。圖4？前脂肪細胞和皮膚成纖維細胞生長過程中細胞內脂肪含量的變化。前脂肪細胞和皮膚成纖維細胞在培養中的變化
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成纖維細胞胞質內可積聚大量脂滴，但無或僅有少量脂滴。這證明SVF是具有增殖和分化成脂肪細胞潛能的前脂肪細胞。本實驗研究的結果與它們壹致，也與文獻[6]提出的三個標準壹致。此外，近年來也有報道稱，脂肪組織塊與天花板培養相結合的方法也獲得了成功[7]。該方法獲得的前脂肪細胞不同於SVF，可能來源於Carraro等在成熟脂肪細胞中發現的細胞島，但該方法是在血清中培養，與成熟脂肪細胞壹起孵育，不適合成熟脂肪細胞分泌的某些細胞因子的體外研究模型。
前脂肪細胞的培養闡明了增殖和分化之間的關系，目前認為是生長停頓？再次成長？細胞分化的連續關系。生長暫停是必要的第壹步，在此之後，這些細胞在繼續轉化為成熟的脂肪細胞之前至少還要經歷壹次分裂。甘油會隨著時間的推移出現嗎？3?磷酸脫氫酶(GPDH)mRNA是壹種晚期標記物，也是脂肪合成所必需的限速酶，最終成為脂肪細胞。我們的研究還觀察到，細胞經過壹段時間的孵育後開始生長，大約3、5天增殖，1周後開始積累脂肪顆粒。培養2周後，脂肪細胞分化為脂滴或脂滴，與文獻報道壹致。
油紅O染色提取法可簡單快速地定量體外培養前脂肪細胞的轉化率。文獻中報道的準確度和靈敏度與GPDH相似，後者是測定前脂肪細胞分化過程中的標誌酶[2]。因此，常被用於鑒定體外培養的前脂肪細胞。在胰島素和氫化可的松的作用下，體外培養的前脂肪細胞的GPDH開始上升並迅速增加，在8天左右達到高峰並維持在較高水平[2]。我們采用油紅O染色提取法進行研究。結果表明，前脂肪細胞在培養第3天開始積累脂肪，1周後積累量明顯增加，2周時達到高峰，與形態學培養1周後細胞內出現脂肪顆粒相壹致。也說明酶的出現在先，脂肪的出現在後，細胞內脂肪含量的明顯增加比GPDH晚約1周，與文獻報道壹致[2]。
3.3?人前脂肪細胞培養技術的特點
脂肪組織來源於原始網狀結締組織，由結締組織和脂肪細胞組成。脂肪細胞是主要的細胞成分，此外還有網狀細胞、間充質細胞、組織細胞、內皮細胞等。脂肪細胞和成纖維細胞都來自中胚層，所以培養的脂肪細胞和成纖維細胞是相似的[9]，外部培養條件不同[10]2006 54 38，22 (6)。不同的是，它們需要成脂因子的作用。目前，這類物質被稱為胰島素、糖皮質激素和糖皮質激素。異丁基？1?甲基黃嘌呤、纖連蛋白等。壹般以DMEM和F12為培養基，配比為1！1比例，細胞數量適中，初始接種時細胞黏附不是很牢固，移動要輕柔，避免細胞漂浮。所選材料越年輕，越容易生長。人類壹般選擇外科手術切割腹部脂肪組織，如果用註射器吸，容易損傷細胞，降低存活率。(本文圖1，2見插圖2)參考文獻:[1] Haunerh，Petruschketh，Russm等.腫瘤壞死因子α(TNF？)onglucosetransportandlipidmetabolismofnewly？differentedhumanfatcellincellculere[J].糖尿病，1995，38(7):764。[2]拉米雷斯？卡斯特羅的ZacariasJL？穆諾茲列多夫，庫裏？Har？cuchW。定量ofadiposeconversionandtriglyc？[1]李，李，等.組織化學，1992，97 (6): 493。[3]趙？幫派，劉建中。醫學細胞生物學實驗與練習[M]。北京:科學出版社，1999.35。[4]杜乃法。insulinationinthepolysicovalysyn？drome[J]。內分泌激素和內分泌激素。MetabClinNorAm，1999，28(2):341。[5]梅傑·比林斯。Historicalreviewandpresentsta？tusoffreefatgraftautotransplantationinplastic Andre？建築外科學[J].PlastReconstrSurg，1989，83(2):368。[6]範爾勒，貝利斯塞，龍卡裏達克。成人臍血前體細胞培養的細胞學和酶學特征[J].JCLININvest，1976，58 (9): 699。[7]朱小海，何青蓮，林子豪。人前脂肪細胞培養、增殖和分化模型的建立[J].中國整形燒傷外科雜誌，1999，15 (3): 199。[8]卡拉羅，李，約翰遜。易易工作室-各種在線工具，站長網誌，以及多個應用項目。Celtissres，1991，264 (2): 243。[9]劉？清·鄧·。內皮-平滑肌共培養:細胞間相互作用對組織纖溶酶原激活劑的影響[J].中山醫科大學學報，1992，13 (4): 18。[10]朱永元，李天增，蘇愛雲，)