1 試劑
包被緩沖液：20mmol/L Tris-HCI(pH9.5），含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3;
洗滌液：20mmol/L Tris-HCI(pH7.5），含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20;
稀釋液：20mmol/L Tris-HCI(pH7.5），含150mmol/L NaCl0.45%脫脂奶及變性鮭魚精DNA (0.1mg/ml)
2 操作
1）包被
用包被緩沖液稀釋抗原（BSA），加入微滴板中（45μl孔），4℃過夜（約15h），用洗滌液洗板3次×5min。
2）封閉：
每孔加200μl含4.5%脫脂奶及變性鮭魚精子DNA（1mg/ml）、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl(pH7.5）（含150mmol/L NaCl緩沖液，37℃溫育80min，洗板數次。
3）抗原抗體反應：
用釋釋液1:8000稀釋單克隆抗BSA抗體，每孔加50μl，室溫（～22℃）下45min，洗板孔15次×10min，去除未結合的抗體分子。
4）鏈親合壹蛋白A結合反應：
每孔加入50μl用稀釋液稀釋的已與生物素-pUC19結合的鏈親合素-蛋白A嵌合體，室溫（～22℃）50min，使得嵌合體-pUC19結合於固相的抗原抗體復合物上，然後洗板15次×10min，再用無NaN3的TBS洗3次，然後即可將微滴板用於後面的PCR反應。
5）PCR
實驗條件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5mmol/LMgCl2、明膠（10μg/ml）、0.8mmol/LdNTPs（每種0.2mM）、2μM引物（每壹引物1μM）和TaqDNA多聚酶（50U/ml）。
PCR周期 PCR前，用紫外線（UV）（254nm）照射上述反應混合物，然後將之加入到微滴板孔中，每孔40μl，再加20μlUV照射的石蠟覆蓋，按下述溫度在PCR儀上進行PCR周期：起始變性94℃5min;30個周期：變性94℃5min，退火58℃1min，延伸72℃1min，最後延伸72℃ 5min，得到的PCR產物為特定的261bp的片段。 ⒈ 用0.85% NaCl將細菌溶液稀釋至壹定濃度。
⒉ 加50μl於微孔板內，4℃過夜。同時設陰性對照（加50μl 0.85% NaCl於另壹孔內）。
⒊ 用400μl的0.05% 溫20pBS（以下簡稱TPBS），洗滌五次。
⒋ 加入2.25%的100μl正常山羊血清（NGS) PBS封閉2小時.
⒌ 用含0.15% NGS的TPBS洗3次.
⒍ 加入100μl用0.75% NGS適當稀釋的單克隆抗體（內含100μg的鮮魚精DNA），室溫孵育30min.
⒎ 用TPBS洗滌五次.
⒏ 加入50μl適量稀釋的生物素化抗鼠IgG抗體，室溫孵育30min.
⒐ 用TPBS洗滌五次.
⒑加入60μl適量稀釋的生物素化DNA和親和素，室溫孵育30min.
⒒用TPBS洗滌五次，再用HPLC級水洗三次.
⒓PCR擴增：加入50μl PCR反應液（內含T3和T7引物），95℃ 60sec,50℃ 110sec,72℃ 110sec，循環30次.取PCR產物10μl於1.7%瓊脂糖凝膠上電泳，和核酸分子量標準相比較，在相應的位置郵現電泳帶為陽性.必需時將電泳結果照相，進行定量分析. 1）凝膠檢測系統 用凝膠掃描儀或計算機輔助視頻設備對溴化乙錠染色的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠進行定量，放射性標記的擴增產物可通過放射自顯影定量測定，最近用自動DNA測序儀檢測熒光標記的核酸，這種方法可準確測量擴增產物的大小，而且其檢測靈敏度達fg水平，但由於自動DNA序列儀和熒光標記引物極為昂貴，所以現在僅用於研究。
2）HPLC檢測系統 此法的優點為PCR產物不用純化，對未標記的產物靈敏度可達fg水平，對標記產物的檢測限度可能更低。HPLC能區分不同分子的大小，可允許我們使用不同大小的內標衡量擴增的效率。
3） 固相測定系統 最常用的為96孔聚苯乙烯微量滴定板，可用儀器比色或讀數，可用親合素分子通過疏水相互作用包被滴定板，此固相系統可特異結合生物素或生物素化的分子可用於生物素化的PCR產物的定量，如用生物素和地高辛雙重標記的擴增產物可用微量滴定板法定量，將生物素和地高辛同時標記PCR產物的方法有三種途徑：①在反應混合物中同時加入地高辛和生物素標記的脫氧核苷酸類似物（DIG-/Bio-dUTP）；②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP；③加入生物素引物1和地高辛標記的引物2。定量方方法為：雙重標記的擴增產物用乙醇沈澱以去除未結合的標記物，然後加至親合素包被的微量滴定板上溫育至少2小時，洗滌數次後，與DIG抗體：AP結合物溫育，根據其底物不同可產生不同的顏色，親合素介導的固相捕獲生物素標記靶分子的技術是壹個有效、靈活和容易操作的技術，將成為定量PCR的壹個關鍵技術。
4）SPA(Scintillation Proximity Assay）系統 用親合素包被的氟微球作為固相載體，用生物素標記引物，在擴增時摻入氟化的核苷酸，擴增完成後，加入已包被的氟微球以捕獲生物素化的PCR產物，此捕獲過程可使與氟微球緊密結合，氟被氘激發產生光脈沖，可用閃爍計數儀測量。與比色法相比，此法具有更大的線性範圍。
5）點雜交檢測系統 將擴增產物變性後固定於尼龍膜表面，與標記的DNA探針雜交，亦可將序列特異的寡核苷酸探針通過多聚T(poly T）尾巴固定於膜上，與變性後的已標記的擴增產物雜交，在後者由於靶基因不是直接結合於膜表面，故其反應動力學接近於液相，反應速度快，通常使用生物素化的探針或擴增產物，用親合素-AP結合物產生顏色斑點，通過與已知濃度的標準比較顏色強度進行定量。
6） 電化學發光檢測系統 通過親合素-生物素系統將擴增產物結合於磁性珠，然後與2，2'-聯吡啶-釕螯合物（TBR）標記的探針雜交，加入三丙胺（tripropylamine，TPA）溶液，並轉移至電化學發光儀的檢測池，當電極的電壓增加至壹定水平時TPA和TBR都瞬時氧化，TPA氧化後生成壹種不穩定的、具有高度還原性的中間物質，可與氧化的TBR反應，使之進入激發態，當由激發態變為基態時可發射出620nm的光，發光強度與TBR標記物的量成正比，通過發光強度對PCR產物定量，此法的敏感性為amol水平，可自動化測量。
7） DNA酶免疫測定系統 通過抗DNA單克隆抗體與擴增產物結合、再通過酶第二抗體結合物進行定量測定。此法不需對引物和擴增產物進行標記，但易出現交叉反應和單克隆抗體昂貴的費用限制了此法的廣泛應用。
8） 激光誘導熒光檢測法 首先用熒光標記物FAM（商品名）的N-羥基琥珀酰亞胺酯衍生物借助氨已基連接臂偶聯於正向引物的5'-核苷酸上，然後PCR擴增，用毛細管電泳擴增產物，最後用氬離子激光光原檢測器檢測熒光強度進行定量測定。此法的優點為樣本用量少，可自動化檢測，快速、靈敏和高分辨率。
總之，可用上述方法對靶基因定量，其準確性可通過復管測定和利用內標使數據標準化而得到提高。由於親合素介導的固相捕獲生物素標記靶分子的技術具有有效、靈活和容易操作等特點，有較好的臨床應用前景。定量PCR仍然存在技術上的問題，目前多用於研究，但在腫瘤、細菌、真菌和病毒性疾病的診斷和治療方面對此技術的需求將日益增加。