1937年,諾貝爾獎獲得者ArneTiselius教授利用壹些電泳現象,發明了最早的界面電泳,用於蛋白質分離的研究,開創了電泳技術的新紀元。
此後,各種電泳技術和儀器相繼問世,先進電泳儀器和電泳技術的不斷發展,使其在生化實驗技術中占有重要地位。根據電泳原理,電泳分離系統有三種形式:原則上按電泳原理來劃分,即移動界面電泳、區帶電泳和穩態電泳或置換(置換)電泳。
自由移動界面的電泳,通過觀察界面的移動來測量帶電分子的移動速率,已經成為歷史。
相反,使用帶支持介質的區帶電泳。
區帶電泳的臨床應用價值因支持物類型、顆粒大小和電泳方法的不同而不同。
固相支持介質可分為兩類:壹類是濾紙、醋酸纖維素膜、矽膠、氧化鋁、纖維素等;另壹種是澱粉、瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。
由於其精細的多孔網絡結構,不僅可以產生電泳,還具有分子篩效應,小分子會跑得比大分子快,提高分辨率。
它最大的優點是幾乎不吸附蛋白質,所以電泳不會出現拖尾現象。
低濃度瓊脂糖電泳相當於自由界面電泳。蛋白質在電場中可自由穿透,負力小,分離清晰,透明度高,可穿透波長200 ~ 7000nm的* *帶的檢測靈敏度。因此,第壹種類型的支持介質已被第二種類型所取代。
穩定電泳或置換電泳的特點是分子粒子的電泳遷移在壹定時間後達到穩定狀態,如等電聚焦、等速電泳等。
區帶電泳是臨床檢驗領域應用最廣泛的技術,具有重要的臨床意義,特別是其他新技術的出現,擴大了其應用範圍,提高了檢測技術。本文綜述了這壹技術的現狀和發展。
1.正確解讀電泳結果有助於臨床疾病判斷的參考。
新鮮血清可以準確描述蛋白質電泳後的全貌。通常,白蛋白減少,球蛋白區域增加,提示不同的臨床意義。
比如急性炎癥時,可以看到a1,a2面積百分比增加;腎病綜合征和慢性腎小球腎炎時,白蛋白降低,a2球蛋白升高,β球蛋白也升高。缺鐵性貧血時,β帶可能因轉鐵蛋白增加而增加,而慢性肝病或肝硬化時白蛋白明顯減少,R球蛋白增加2-3倍,說明免疫球蛋白多克隆增加,甚至可見β-r融合橋接現象,R區可顯示細而密的寡克隆帶;血清蛋白電泳是檢測單克隆漿細胞異常增殖產生的具有均壹無抗體活性的免疫球蛋白M蛋白的首選方法。
它可以在電泳區的a2-r區呈現壹個密集、染色深、濃度高的蛋白克隆增殖帶,稱為M蛋白帶。掃描後形成壹個高而窄的個體峰。如果有些峰在R區,則峰高與峰底寬之比>;2: 1,但由於正常免疫球蛋白合成的限制,背景染色較淺。
多發性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、重鏈病、遊離輕鏈病、半分子病、良性單株γ球蛋白血癥、雙M蛋白血癥等壹批由M蛋白引起的疾病,目前並不少見。
血清蛋白電泳對該類疾病的早期診斷、療效觀察和預後判斷具有重要意義。
第二,電泳技術與免疫技術的結合大大擴展了其臨床應用範圍。
允許電流加速抗原和抗體的擴散並指定其運行方向,從而加速沈澱反應。
免疫電泳技術的種子有很多,如對流免疫電泳(CIEP)、火箭免疫電泳(RIE)和電免疫擴散(EID)。
在這些免疫電泳方法的基礎上,不斷衍生出壹些新技術,如免疫電泳(IEP)。在1969中,Alper和Johnson推薦了免疫固定電泳(IFE),這是壹種瓊脂糖凝膠電泳和免疫沈澱的混合技術。待檢測的樣品可以是血清、尿液、腦脊液或其他體液。
1976再次推薦血清免疫固定電泳(IF)進行M蛋白分型。
在瓊脂糖凝膠介質上通過電泳分離血清蛋白後,將固定劑、各種免疫球蛋白和輕鏈抗血清施加到凝膠表面的泳道上。孵育後,固定劑和抗血清在凝膠中滲透和擴散,如果相應的抗原存在,則在適當的位置形成抗原-抗體復合物。
染色後,蛋白質電泳參考泳道和抗原-抗體沈澱區帶用氨基黑染色,根據電泳移動距離分離單克隆組分,從而可以對各種免疫球蛋白及其輕鏈進行分型。
該技術的最大優點是靈敏度為50-150mg/dl,操作周期短,分辨率高,結果易於分析。
目前最常用於M蛋白的分型鑒定,已納入臨床實驗室常規檢測。
第三,利用電泳技術分析同工酶譜,提高診斷率。
1.血清乳酸脫氫酶同工酶(iso-LDH):測定LDH同工酶的方法有電泳法、離子交換柱層析法、免疫測定法、抑制劑法和酶消化法,但瓊脂糖凝膠電泳仍是迄今為止應用最廣泛的方法。
電泳分離後,應分離出5條同工酶帶。平均LDH 1在急性肱二頭肌梗死發病後6小時開始升高,LDH1/LDH2≥1為心肌損傷的陽性決定性水平。LDH5在肝癌中明顯升高,並測定了各條帶的含量。電泳分離的同工酶譜經掃描定量,其準確性明顯高於肉眼判斷。
2.血清肌酸激酶同功酶(CK);CK和CH-MB的測定仍然用於確認急性心肌梗塞。
近年來,國內已有單位采用免疫抑制法測定CK=MB,其原理是抵抗M亞基的酶活性。因為正常血清中幾乎沒有CK=BB,所以這個值乘以2可以認為大致代表了CK-MB的活性。
該方法簡單、快速,但其缺點是特異性差。如果患者血清中有CK-BB或CK異常,就會出現假性增高。
許多作者報道了異常的CD-同工酶,其中壹種叫做macro-CK(Maxro-major),是CK-BB和免疫球蛋白的復合物,有IgG和IgA,正常血清中Marco-CK只占0.8%-1.6%,另壹種叫做線粒體CK(CK-MT),與肌肉、大腦和腦結合。CK-MT不出現在正常血清中,也不出現在心肌梗塞中。只有在組織極度損傷,線粒體和細胞壁極度破壞的情況下,才能在血清中檢測到。
巨CK和非典型CK-MT不能被M抗體抑制,所以當它們出現時,會導致CK-MB高於CK總活性的虛假增加。
電泳分離CK-MB是基於CK-同功酶的分子結構不同,由醫學教育網收集整理在電泳緩沖液中,帶不同電荷。從陰極到陽極可以分離出CK的不同組分,分別是CK-MM、CK-MB和CK-BB。電泳特點是出現異常的2種同工酶時,如巨CK ⅰ和巨CK ⅱ,從電泳圖譜上很容易發現,每種酶都可以用掃描儀檢測出來。
宏觀CK在CK毫米和CK毫米之間,而CK山靠近陰極,在CK毫米後面..
這樣,CK-BB和各種異常同工酶就不會被誤認為CK-MB而被誤診,CK-MB假增高的錯誤原因也就迎刃而解了。
因此,CK同工酶電泳是壹項非常實用的檢測技術,具有非常重要的臨床意義。
3.CK亞型的同工酶:另外,CK-MB和CK-MM亞型的測定常采用瓊脂糖凝膠等電聚焦電泳或高壓電泳。由於操作比壹般電泳麻煩,常規測定無法推廣。
目前進口全自動電泳儀配有試劑盒,可用於CK亞型分析。參考值為CK-mm 1(57.7±4.7)%;CK-MM2為(26.5±5.3);CK-MM3為(15.8±2.5)%;CK-MM3/CK-MM1的比值為0.28±0.05(範圍為0.15-0.39),陽性決定水平為>:0.5。MM3在第壹天占優勢,而MM1在第二天以後占優勢。
通過電泳分離出CKMB。CKMB1和CKMB2在正常血液中很小,比例幾乎似是而非。急性心肌梗死後,血液循環中可檢測到4-6hCKMB2亞型,故MB2/MB1比值明顯升高,早於總CK-MB片段。
當心梗緩解後,這個比例會逐漸降低。
也可用於觀察溶栓治療後的情況。
第四,結合酶免疫標記抗體技術檢測腦脊液中的寡克隆條帶。
據報道,雙向電泳和銀染是分離和鑒定腦脊液蛋白的常用方法,這種方法既復雜又費時。現在,通過高分辨率瓊脂糖凝膠電泳分離腦脊液中的蛋白質,通過抗原與辣根過氧化物酶標記的特異性IgG抗體的反應來鑒定“OCB”。經過酶免疫標記擴增技術和顯色步驟後,當濃度達到31-125ul/L時即可檢測到蛋白質,可將檢測靈敏度提高100倍,使腦脊液無需濃縮,避免了濃縮過程中蛋白質的損失。
可用於確認和區分OCB免疫球蛋白及其類型。
如果在腦脊液樣本中檢測到OCB,但相應樣本中未檢測到條帶,則為陽性,真實反映了中樞神經系統自身合成的免疫球蛋白,具有重要的臨床意義。
這是壹個定性的測試,OCB是多發性硬化癥的壹個非常重要的標誌。
但是,應在同壹天同時分析患者的血清和腦脊液,以識別不同來源的免疫球蛋白。
中樞合成免疫球蛋白是中樞神經系統疾病的重要信號,主要用於多發性硬化、癡呆、脊髓炎、副腫瘤性腦炎、神經梅素病等中樞神經系統疾病的鑒別診斷。
5.通過固相抗原抗體反應分離脂蛋白(A ),用於檢測心腦獨立危險因素。
該技術是通過抗原抗體反應對電泳分離的脂蛋白進行鑒定。
瓊脂糖凝膠電泳和染色後,血清中可出現不同的脂蛋白帶。
由於凝膠中脂蛋白的等電點不同,不僅可以區分A、前β、β帶,而且介質中存在抗LP(a)抗體和陽離子,抗LP(a)與患者血清中的LP(a)結合形成復合物,而陽離子抑制其他脂蛋白的遊動速度,使LP(a)與其他脂蛋白分離,使LP (A)具有非常清晰的分辨率。掃描陽性條帶後,可以得到條帶的面積和百分含量。這種方法使電泳技術更加完善,大大減少了人工操作的弊端,不僅可以半定量,還可以保存膠片進行對比。
提高檢測心腦血管疾病獨立危險因素LP (a)的敏感性和特異性。
6、根據分子量進行非濃縮尿蛋白電泳,區分尿蛋白類型。
尿蛋白電泳可以分離出尿液中的各種蛋白質,以區分尿蛋白的類型,在臨床上不需要手術就可以幫助判斷腎臟受損的部位。
國內壹些實驗室使用SDS-PAGE圓盤電泳分離尿蛋白。這種方法局限性大,耗時長,操作復雜,對樣本要求高,尿液需要預濃縮,不適合臨床實驗室。
SDS=AGE電泳不需要預濃縮,尿蛋白電泳顯示以反應性腎小球病變為主的中高分子量蛋白區。呈現低分子量蛋白帶,可見於腎小管病變和溢出性蛋白尿;混合性蛋白尿可見大、中、小分子量帶,說明腎小球和腎小管均有受累。
掃描儀可以掃描電泳後尿液中的蛋白質圖譜,找出百分比,從而顯示腎小球或腎小管損傷的程度,其電泳圖譜和掃描圖可以永久作為國家數據,有利於分析比較。
該技術最大的進步在於尿液無需預濃縮,操作簡單,結果明確,僅需三個小時即可完成實驗,並有完整的定性標準,易於量化分析,對腎臟疾病的診斷、鑒別診斷、指導治療和判斷愈合具有重要價值。
最近發展起來的毛細管電泳是壹種新型的區帶電泳,也稱為毛細管區帶電泳。
在毛細管中填充緩沖溶液,將樣品註入毛細管的壹端,在毛細管的兩端施加DC高壓使樣品分離,分離後的樣品依次被安裝在毛細管壹端的檢測器檢測。
毛細管電泳也廣泛用於實驗室醫學。從檢測樣本的來源來看,可分為尿樣、血漿、血清、腦脊液、紅細胞、其他體液或組織、實驗動物。
從分離對象來看,包括蛋白質、肽、氨基酸、糖、酶、DNA、寡核苷酸、病毒、生物活性小分子、離子、藥物及其代謝產物。
可分為臨床疾病診斷、臨床蛋白質分析、臨床藥物分析、代謝研究、病理研究、同工酶分析、PCR產物分析、DNA片段和序列分析等。
由於其無可比擬的高效性和快速性,受到了越來越多科學家的關註。
我國的電泳技術起步不算晚,但由於種種原因,大多數實驗室仍然使用相對落後的電泳設備。
隨著國際國內科學技術的飛速發展和檢驗醫學的飛速發展,電泳技術也在不斷發展和更新,在臨床醫學和分子生物學領域具有極其廣泛的應用價值。相信隨著這項技術的不斷發展,會越來越受到同行的青睞。