——4—江蘇農業科學2003年第2期可以找到更多的標記，但缺點是RAPD標記多為表型，無法區分基因型是純合還是雜合，每個標記提供的信息少，重復性差。RAPD標記通常是重復序列。如果它們不是重復序列，它們也可以被轉化成RFLP標記以進壹步檢測RAPD分析的結果。1，隨機引物(10mer) (5umol/L):買成品。
2、Taq酵素:買成品。
3.10xPCR緩沖區:公式見第8章。
4、氯化鎂:25毫摩爾/升.
5.dNTP:各2.5mmol/L。1.在25ul反應系統中，添加
模板DNA 1ul (50ng)
隨機引物1ul(約5pmol)
10xPCR緩沖液2.5微升
氯化鎂2ul
dNTP 2ul
Taq酶1單位(u)
添加ddH2O至25ul。
混合均勻並輕微離心，加入壹滴礦物油。
2.在加熱到90℃以上的PCR儀中94℃預變性2分鐘，然後循環:94℃ 1分鐘，36℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，* * 40個循環。
3.循環後，在72℃下儲存10分鐘和4℃。
4.取PCR產物15ul和3ul上樣緩沖液(6x)在2%瓊脂糖凝膠上電泳，電壓穩定在50-100V(電壓低，帶型整齊，分辨率高)。
5.電泳後，觀察並拍照。
【註】1。壹般電泳時有5-15條RAPD帶，大小為0.1-2.0kb
2.可以克隆特定的DNA條帶，並將其用作新的分子標記。原理RAPD技術是基於PCR技術。它使用壹系列(通常數百個)具有隨機排列堿基序列(通常10 bp)的不同寡核苷酸單鏈作為引物，用單壹引物擴增所研究的基因組DNA。模板DNA在90-94℃變性和熔化，然後在較低溫度(36-37℃)退火。此時單鏈模板會有許多與引物互補的位點，在72℃下，通過鏈延伸形成雙鏈結構，完成DNA合成。重復上述過程，可以產生不同片段大小的擴增產物，通過電泳分離和顯色可以得到許多不同的條帶，從中可以篩選出特征條帶。擴增產物片段的多態性反映了基因組DNA的多態性。如果在這些區域插入、缺失或堿基突變DNA片段，這些特異性結合位點的分布可能會發生相應的變化，PCR產物會出現分子量的增加、缺失或變化。因此，可以通過檢測PCR產物來檢測這些區域中基因組DNA的多態性。當進行RAPD分析時，可用的引物數量非常大。雖然基因組DNA多態性的檢測區域對於每個引物都是有限的，但是通過使用壹系列引物，檢測區域幾乎可以覆蓋整個基因組。因此，RAPD可以檢測整個基因組DNA的多態性。
RAPD技術的優點是:①不使用同位素，減少了對工作人員健康的危害；②不需要任何分子生物學研究就可以分析物種的DNA多態性；③模板DNA純度不高；④技術簡單，不需要克隆DNA探針和進行分子雜交；⑤靈敏度高，多態性豐富；⑥RAPD引物沒有嚴格的物種界限，同壹套引物可以應用於任何生物的研究，因此具有通用性和普適性。
然而，RAPD技術很容易受到各種因素的影響。無論模板的質量和濃度，短引物序列，PCR的循環次數，基因組DNA的復雜程度，技術設備等。，這可能是RAPD技術重復性差的直接原因。目前從以下幾個方面來提高反應的穩定性:①規範操作，反應體系的組成要壹致，盡量規範RAPD反應；②提高擴增片段的分辨率；③將RAPD標記轉化為SCAR標記，然後進行常規PCR分析，可以提高反應的穩定性和可靠性。
RAPD技術在魚、蝦、蟹研究中的應用
2.1在遺傳資源研究中的應用
目前海洋蝦蟹類的遺傳變異大多是通過檢測同工酶的變異來檢測的，揭示的同工酶多態性相對較低。隨機擴增多態性DNA (RAPD)分析需要的樣本非常少，操作程序簡單易行，實驗周期短，可以分析大量的樣本。利用壹套引物可以獲得不同物種、品系、種群甚至個體的大量RAPD分子標記，並可以借助計算機進行系統分析。RAPD技術的這些特點使其在蝦蟹類群體遺傳學和遺傳多樣性分析中發揮了重要作用。
RAPD標記可用於研究蝦蟹類的群體遺傳學，檢測群體內和群體間的遺傳多樣性水平，為群體鑒定提供可靠的遺傳標記。Garcia等人試圖通過RAPD對斑節對蝦不同地理群體間的遺傳多樣性進行分析，並對其在對蝦育種中的應用進行了初步探討。加西亞和a 1西瓦爾-沃倫等。對南美白對蝦高健康無特定病原體(SPF)養殖的野生群體和不同家系進行監測分析，發現多態位點比例約為50%，壹個家系中多態位點比例高達77%。劉萍等人利用RAPD技術研究了中國對蝦沿海群體親本及其後代的基因組DNA多態性。結果表明，子代間的遺傳距離小於親本與子代間的遺傳距離，遺傳變異程度較低。邱等人利用技術分析了煙臺和長島的20個中國對蝦群體內和群體間的遺傳差異。結果表明，不同地理種群間存在壹定的遺傳差異。、和劉等人對中國對蝦不同地理群體的遺傳多樣性進行了分析。結果表明，中國對蝦的遺傳多樣性水平較低。高誌幹等人對遼河和長江的中華絨螯蟹種群進行了RAPD分析。結果表明，中華絨螯蟹種內遺傳變異較低。在三個群體中，遼河群體和弋江群體的遺傳變異較大，而長江群體的遺傳變異較小。遼河流域種群間的遺傳距離小於種群間的遺傳距離。RAPD研究了羅氏沼蝦NY群體和NX群體的遺傳多樣性，NY群體的變異明顯小於NX群體。宋和莊誌猛用RAPD技術研究了日本對蝦野生群體和養殖群體的遺傳結構。結果表明，野生群體的多態位點比例和雜合度顯著高於養殖群體，表明中國沿海日本對蝦野生群體的種質資源狀況良好，應予以保護。
壹份詳細的遺傳連鎖圖譜不僅對該物種的基礎遺傳研究具有重要意義，而且對該物種的育種研究也有幫助。Potlethwait和Stephen利用RAPD技術繪制了斑馬魚的遺傳連鎖圖。劉將技術應用於鯰魚基因圖譜研究。孫小雯等人建立了鯉魚的遺傳連鎖圖譜。圖譜中有56個RAPD分子標記，26個鯉魚SSLP標記，19個鯉魚SSLP標記，70個斑馬魚SSLP標記，91個鯉魚基因標記，50個連鎖群。連鎖圖譜顯示鯉魚的基因組大小約為5789cm。
2.2確定物種和品種之間的親緣關系。
傳統的種群親緣關系研究方法以形態學、細胞學和生化指標為基礎，但受個體和環境影響較大，有時不能反映物種本身的固有特征。物種基因組的組成反映在RAPD地圖上。親緣關系越近，基因組中同源序列越多，同壹引物擴增出的標記* * *越多。因此，RAPD技術與傳統方法相結合是研究物種親緣關系的有效手段。RAPD分析不同物種、同壹物種不同種群的DNA，篩選出特征條帶，計算相似系數和遺傳距離，從而確定它們的親緣關系。李思發等人利用RAPD技術研究了中國沿海六大水系中華絨螯蟹(中華絨螯蟹和日本絨螯蟹)的親緣關系。從48個引物中篩選出2個具有群體特異性的引物，其中Z2擴增的880bp片段為珠江口蟹和南流江蟹所特有，Z2擴增的700bP片段為長江蟹、黃河蟹、遼河蟹和甌江蟹所特有。這可以作為區分中華絨螯蟹(長江蟹、黃蟹、遼河蟹、甌江蟹)和日本絨螯蟹(珠江蟹、南流江蟹)的分子遺傳標記。利用RAPD技術對中國沿海6個水系中的2種中華絨螯蟹進行了分類，其結果與生化遺傳差異分析和形態學多元分析的結果壹致。宋利用對6種對蝦的親緣關系進行了研究，用20個隨機引物進行擴增，獲得了364條清晰穩定的多態性片段。根據擴增片段的* * *享用度，計算相對遺傳距離指數，然後用UPGMA和NJ聚類方法進行分析，構建系統進化樹，確定它們的親緣關系。聚類分析結果表明，中國對蝦、長毛對蝦和日本矛線蟲的親緣關系最近。它們先聚在壹起，然後是斑節對蝦，最後是南美白對蝦和日本對蝦。從結果可以看出，外部形態相似的物種在基因組DNA上表現出很大的相似性，反之亦然。宋等人利用對六種海蝦的基因組DNA多態性進行了研究，結果表明六種蝦的親緣關系與傳統分類結果基本壹致。謝浩通過RAPD對三種中華絨螯蟹的親緣關系進行了研究，用壹套引物對每個物種的65，438+00個個體的基因組DNA進行擴增，得到了壹批特異的、可重復的擴增圖譜。擴增條帶分析表明，中華絨螯蟹與日本絨螯蟹較遠，而南流江的中華絨螯蟹(合浦亞種)與日本絨螯蟹較近。
Borrwsky等人用隨機引物擴增產物重建了脊椎動物的DNA指紋。Sultman等人使用DNA標記來研究麗蠅科魚類的系統發育。何順平等分析了RAPD的五種鯉科魚類，討論了鯉魚的系統位置。何順平等人通過對鯉科魚類的隨機擴增，獲得了大量具有系統發育信息的多態DNA片段，繪制了低等鯉科代表性屬種的系統發育圖。夏德用RAPD法分析了太湖銀魚、新銀魚、新銀魚三種銀魚的親緣關系，發現部分樣品的核基因組與太湖幾種銀魚的核基因組存在顯著差異。鄒樹明等人利用RAPD研究了草魚、鯉魚和鯉魚三個地理種群之間的親緣關系，結果支持了中國東部魚類具有雙重起源的觀點。
2.3特定基因的標記
可以使用DNA分子水平的變異作為基因標記的遺傳標記。周開亞等人利用RAPD對中華絨螯蟹種群進行了研究和鑒定，並利用200個隨機引物對中華絨螯蟹遼河種群、長江種群和甌江種群進行了RAPD分析。其中，引物HX01和HX02檢測到甌江群體和遼河群體* *的所有樣本均有Hx01-0.4和HX02-0.7的擴增片段；但這兩個擴增片段在長江種群樣本的PCR反應中沒有出現，因此可以作為長江種群的鑒定標記。沒有發現區分甌江種群和遼河種群的標記。謝浩利用RAPD對三種中華絨螯蟹的親緣關系進行了研究，用引物OPO-05擴增出中華絨螯蟹25個個體、日本絨螯蟹27個個體和日本絨螯蟹亞種12個個體。結果發現，中華絨螯蟹的所有個體都能擴增出壹條大小約為1kb的條帶，該條帶相當明顯且穩定，而其它兩種的少數個體在相同條件下只能擴增出相當微弱的條帶。因此，該帶可作為區分中華絨螯蟹和日本絨螯蟹及其合浦亞種的遺傳標記。
目前，RAPD已被廣泛用於識別和鑒定不同的生物物種。Johnson用RAPD技術鑒定了不同實驗室品系的斑馬魚。薛國雄分析了長江、珠江和黑龍江的草魚產卵場覆蓋範圍和RAPD在太湖捕撈的草魚。結果表明，各水系草魚群體都有各自的特征基因圖譜，可作為群體鑒定的依據。夏德全恒檢測了壹個奧利亞羅非魚育種群體和胡翔、美國、沙市三個尼羅羅非魚育種群體，獲得了區分尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚的分子遺傳標記。姚繼華等人利用20個隨機引物對方正、彭澤和齊河地區的3個鯽魚群體進行了RAPD檢測，也獲得了用於鯽魚群體鑒定的分子標記。鄧淮等人用RAPD—PCR擴增了鯡魚、草魚、鰱魚、鱅魚、鯽魚、鯉魚、團頭魴、烏魚、鯰魚和黃顙魚。結果表明，RAPD是壹種非常敏感的種間鑒定技術，尤其適用於魚卵和魚苗的鑒定。鄭光明等人從池塘飼養的鰣魚和小麥鰣魚中提取血液基因組DNA，並使用隨機引物進行PCR擴增。通過縮短擴增時間和電泳時間，快速鑒別出3種不同的鰣魚品種，建立了壹套在DNA分子水平上快速鑒別魚品種的方法。
2.4識別同壹物種的性別差異
蝦蟹類的性染色體沒有統壹的模式，因此無法通過常規的核型分析來鑒定性染色體。利用RAPD技術可以發現不同性別的同壹物種基因組DNA的特征條帶，有助於研究性別控制機制，為性別決定提供分子基礎。陶丘利用RAPD技術鑒定中華絨螯蟹的性別。在200個引物中，17個引物擴增了群體水平的差異，1個引物(OPM14)擴增了個體水平的差異:雄性有壹條800bP的特異帶，而雌性沒有。這可以用作有價值的性別鑒定標記。
2.5監測遺傳滲透以維持物種遺傳多樣性。
目前，人工繁殖活動和人工放流已使蝦蟹不同種群間的非自然遺傳滲透相當普遍，應予以重視、監測和收集，為保護種質資源和維持物種遺傳多樣性提供依據。李思發等人利用RAPD對中國大陸六條河流的中華絨螯蟹進行了親緣關系研究。引物OPP17擴增出的947bP片段在長江、黃河和遼河三個群體中的頻率從南到北顯著降低，長江為87.5%，黃河為41.66%，遼河為10.83%。這種遺傳滲透的量度可以作為區分三個水系的中華絨螯蟹的標準。陶丘等人利用RAPD研究了長江、遼河和甌江三個中華絨螯蟹種群的遺傳多樣性。三個群體間均未發現特征條帶，但群體間差異大於群體內差異。種群間未發現分子遺傳標記，但三個種群間存在差異，說明遺傳滲透是近期種質資源混雜的原因之壹。
RAPD標記可用於群體遺傳學研究，檢測群體內和群體間的遺傳多樣性水平，為群體鑒定提供可靠的遺傳標記。Bardakci等人使用RAPD技術評估羅非魚群體內和群體間的遺傳變異。比勞斯基等人對太平洋海岸的條紋鱸魚進行了RAPD分析。Caccone等人對歐洲黑鱸的DNA多態性進行了RAPD—PCR分析。Garcia等人試圖通過RAPD對斑節對蝦不同地理群體間的遺傳多態性進行分析，並對其在對蝦育種中的應用進行了初步探討。王若梅等利用RAPD技術檢測了野生鯽魚和四種代表性金魚的基因組DNA多態性。張德春利用該技術對兩廣兩個人工養殖鰱魚群體的遺傳多樣性進行了比較研究，為鰱魚人工繁殖的科學規範提供了壹定的理論依據。張思明等人對中華鱘的隨機擴增多態DNA和遺傳多樣性進行了研究。結果表明，中華鱘自然種群細胞核DNA水平的遺傳多樣性較低，這為中華鱘資源的監測和保護提供了理論依據。石拓等人利用該技術檢測了中國朝鮮半島西海岸對蝦群體的基因組DNA多態性，結果表明該群體的遺傳多樣性較低。宋等人對日本對蝦野生和養殖群體遺傳結構的標記進行了初步研究，認為等分子標記技術在海洋動物育種和標記輔助育種中的應用將是海洋動物育種健康發展的有力保障。
RAPD技術簡單快速，不需要事先確定目的基因的序列，無物種特異性。可用的引物不計其數，可以產生足夠的多態性，它可以鑒別物種和種群間基因組的差異，也可以區分個體間的差異。因此，許多從事水產育種的研究人員將RAPD技術應用於水產遺傳育種，並取得了壹定的成果。在海洋魚類(如大黃魚)和海蝦種質資源的研究中，由於同工酶揭示的遺傳差異水平很低，而RAPD比同工酶更能指示DNA多態性，因此RAPD分子標記在魚、蝦、蟹種質資源的遺傳研究中具有廣闊的應用前景。目前，RAPD分析主要用於標記鑒定、遺傳作圖、系統發育與進化、親緣關系研究、種群劃分、種群遺傳多樣性研究等方面。但在實際應用中，RAPD也表現出壹些不足，如陽性位點不能區分後代中的純合子和雜合子；穩定性差；可變性大等缺點。當然，有些是可以避免的。解決的辦法是篩選單鏈引物，優化反應條件，但第壹個缺點是不可避免的。如果RAPD能與RFLP、AFLP、微衛星等其他分子標記結合起來，還是會發揮更好的作用。總之，隨著生物技術的不斷發展和更多的應用，RAPD技術將會更加完善，應用更加廣泛。
與PCR相比，RPAD具有以下特點:①RAPD使用隨機引物，不需要事先知道目的基因和相應的序列。②操作簡單，實驗周期短，可在短時間內篩選大量樣本。③引物具有普遍適應性，適合自動化操作分析。
與RFLP相比，具有以下特點:①RAPD分析只需要少量的模板，壹次擴增只需要20-100ng，有利於DNA少的材料的基因組分析。比如花粉、原生質、種子的DNA分析是可行的。②RAPD標記更隨機，也有利於圖譜構建。對於DNA含量高的物種和多倍體物種，RFLP探針會與多倍體的多個片段雜交，得到的混合指紋會給其他等位基因的闡明帶來困難。此外，由於大量的DNA，進行單拷貝Southern雜交是不實際的，這至少需要長的暴露時間，並且已知探針的數量有限。RAPD大大增加了可以構建遺傳圖譜的物種數量。(3)不需要使用有害同位素，人力物力消耗少。④靈敏度高。引物中個別堿基的變化會引起擴增帶和強度的劇烈變化，這是RFLP無法比擬的。⑤RAPD標記可以覆蓋整個基因組，包括編碼區和非編碼區，可以反映整個基因組的變化。⑥RAPD產物在單拷貝區擴增出50%以上的條帶。克隆和序列分析後，可作為RFLP和原位雜交的探針，廣泛應用於基因定位、克隆和輔助選擇育種。RAPD是壹種全新而有效的遺傳標記，與其他分子標記相比有很多優點:
①合成壹套引物，可用於不同生物的基因組分析。相對而言，RFLP標記具有種族特異性，這限制了它們的應用。
②RAPD技術簡單、省力、省時。不需要RFLP分析的前期工作，如克隆制備、同位素標記、Southern印跡和分子雜交。而且RAPD檢測靈敏方便，可以用熒光染料或同位素標記進行檢測，大大提高了其分析速度。也就是說，使用序列凝膠分析RAPD，壹個人只需36個小時就可以完成120個樣本的分析，而RFLP至少需要壹個星期。
③RAPD分析所需的樣品DNA量非常少。僅為RFLP的1/1000 ~ 1/200，對早期生物取樣鑒定或DNA限制有很大好處。
④由於RAPD用於構建基因圖譜時不需要克隆，因此可以打破克隆載體和宿主的限制，擴大應用範圍。
⑤每個RAPD標記相當於基因組分析中的目標序列位點，可以簡化合作研究項目的信息傳遞過程。
⑥RAPD標記可以為那些RFLP難以區分的基因組區域繪制遺傳連鎖圖。⑦RAPD分析可以自動化，減少了像RFLP那樣繁瑣的程序。
然而，RAPD標記也有壹些缺點。例如，RAPD標記難以區分雜合子和純合子基因型，不能有效地鑒別雜合子。此外，RAPD反應易受外界因素影響，重復性不盡如人意，等等。因此，規範RAPD的實驗條件是非常重要的。Black(1993)總結了壹些影響書目、條帶大小和強度的因素，包括PCR緩沖液。DNTP和Mg2+濃度、循環參數(退火溫度、溫度變化時間、PCR儀器)、Taq聚合酶來源(Schierwater和Ender，1993)、DNA條件和含量(Black等人，1993)。RAPD技術是壹個涉及許多組分的生化反應，反應中的所有組分都是微量的。雖然反應靈敏度高，但影響因素多，會出現重復性差等壹些問題。為了獲得穩定的結果，必須預先優化各種反應參數，操作中的每壹步都必須小心謹慎，防止出錯。
溫度RAPD的壹般反應條件是:變性92-95℃，常用94℃，30-60s；延伸72℃，60-120s；在35-37℃下退火30-60秒。壹般變性和延伸溫度變化不大，退火溫度影響較大。退火溫度低時，引物與模板的結合特異性差，條帶可能增多。退火溫度越高，引物和模板的結合特異性越高。有人建議，在旨在尋找基因差異的實驗中，在33-34℃退火更好。在優化方案中，可以提高退火溫度以減少背景並獲得更少和更清晰的條帶。溫度的梯度率也很重要，尤其是退火和延伸之間的梯度。各種儀器的控溫、升溫、冷卻性能存在差異。壹些儀器(如壹些舊型號)在達到特定溫度之前就開始計時，壹些PCR儀器顯示的溫度與實際溫度不同。在設計程序和分析結果時需要考慮這些，所以需要註明所用儀器的生產廠家、品牌和規格。對於同壹批次的實驗，需要控制反應在同壹溫度下，結果具有可比性。
反應物PCR擴增的效果受多種成分制約，產物僅在某些循環中呈指數增長(2)，並將逐漸達到平臺期。模板是壹個關鍵的制約因素，RAPD產品依賴於它。非常精確的模板濃度是實驗中非常關鍵的壹步。濃度過低，分子碰撞的幾率低，擴增產物不穩定。濃度過高，非特異性擴增產物會增多。更重要的是，如果循環次數控制不好，引物過早消耗，PCR擴增產物的3端會在後面的循環中與原始模板和每個循環的擴增產物退火，導致長度不等的延伸。所以如果原模板濃度過高，非特異性擴增產物足以形成背景，這就是高濃度模板造成產物分散的原因。相對而言，模板純度影響不大，即反應液中的蛋白質、多糖、RNA等大分子物質影響不大。理想的模板和引物濃度可以產生多態性豐富、強弱帶清晰的RAPD圖譜。引物的3末端似乎更重要。此外，Mg+2的濃度也影響反應的參數，包括產物的特異性和引物二聚體的形成。人們在自己的實驗中得出了不同的結論，大概是1.5-4 mmol/L，總之，各種反應物的濃度要提前篩選和優化。
汙染實驗要有空白對照，因為引物、各種緩沖液、雙蒸水都會造成汙染。而且Taq酶也可能被汙染，給分析帶來困難，所以需要設置質控以消除系統誤差。而且酶盡可能優化。
擴增帶的重復為了克服RAPD的不良重復性，應該進行重復實驗。作為DNA多態性的標記，條帶應該是可重復的，重復性好是最重要的選擇指標，但不應以條帶的強弱作為選擇指標。有學者認為，條帶的強弱與其在基因組中的拷貝數有關。但根據Thormann對十字花科植物的分析，RAPD產物的強度與該產物在基因組中的拷貝數沒有直接關系，而與引物和模板的同源性有關。分析壹個軌跡的時候，要綜合分析。如果壹個個體的所有條帶都很弱，可能是它的模板(濃度和分子量)有問題。如果壹個個體的大部分條帶與其他個體壹致，只有壹個或幾個條帶較弱，則可能存在拷貝數的差異。重復性差的弱帶(不規則出現的帶)可能是由於非特異性擴增、產物間退火或其他人為因素造成的，無法記錄。
在研究亞麻銹病時，Ayliffe發現在F1代出現的壹條帶在親本中沒有出現。進壹步研究發現，這條帶是由兩個等位基因組成的異源雙鏈體形成的，除了中間插入的38bp序列外，這兩個等位基因的序列是相同的。在對蜜蜂的研究中也發現了類似的問題，這壹帶可以被單鏈核酸酶消除。也可以將電泳溫度提高到60℃以上，使異源雙鏈體變性，以消除其影響。
根據對非孟德爾帶的分析，如赫恩，顯示多態性的非模糊帶92.5%為孟德爾顯性遺傳，其余帶不是孟德爾遺傳，提示它們可能由不同的序列組成。在壹般實驗中，符合孟德爾遺傳的條帶多用於分析。在連鎖圖譜分析中，基因型錯誤可以部分消除，即在F1代或1: 1混合物中沒有出現的條帶，應盡可能從其親本中去除。
同源同帶Thormann標記RAPD產物為探針，雜交結果顯示與探針片段具有相同遷移率的帶並非來自不同來源，僅發生於物種間。比較了RFLP和RAPD標記在種內和種間的結果。發現RFLP和RAPD標記的結果在種內水平上完全壹致，但在種以上水平上相差甚遠，說明在同壹電泳結果條帶中可能存在幾條序列不同但分子量相同的條帶，RAPD無法檢測到。這種可能性在物種內部很少見，但在物種之間可能性更大。卡斯塔涅通過比較RFLP和RAPD也得出了同樣的結論。
電泳時電泳分辨率的問題，有可能基因組不同位置的擴增產物會壹起移動，即不同分子量的擴增產物在電泳時可能不會分離形成條帶，而凝膠分離系統與基因組的遺傳關系可能會增加這種概率。壹般來說，聚丙烯酰胺和銀染的分辨率效果高於瓊脂糖和乙基溴化銨，使用更長的瓊脂糖凝膠(可達20cm)或更高的濃度(2%)有助於提高分辨率。當然，隨著分辨率和靈敏度的提高，更容易出現實驗誤差。所以有人評論說，最安全最簡單的方法是瓊脂糖脈沖分離，只關註那些重復性高的條帶。而聚丙烯酰胺和銀染揭示的多態性，無疑可以加快分子標記的鑒定進程。
顯性標記問題RAPD標記來自模板DNA的復制。30-40個循環後，擴增條帶數理論上可達2條。無法判斷原始模板中的擴增位點是純合的還是雜合的，因為純合位點的擴增條帶只有雜合位點的兩倍大，電泳檢測不出差異。在雜交中。如果親本中有壹個是純合的，F1代都能表現出這壹帶；如果是雜合子，該帶在F1中應該是l: l分離，即壹半後代有該帶，另壹半沒有。當然，來自多個拷貝區域的條帶分析更加復雜。