江1，辛愛國2，1。
(1.廣西民族大學化學與生態工程學院，廣西南寧530006；2.農業部熱帶亞熱帶動物病毒學重點開放實驗室，雲南昆明650225)
摘要:MicroRNA病毒屬於正鏈RNA病毒，屬於該家族的病毒的基因組結構和基因表達機制是保守的。本文綜述了小RNA病毒基因表達調控的研究，包括不依賴於cap結構的翻譯起始、宿主細胞翻譯的關閉、病毒多蛋白的加工和RNA復制，為闡明小RNA病毒的致病機制和研究真核生物的基因表達調控提供參考數據。
關鍵詞:小RNA病毒；基因表達；內部核糖體進入位點；RNA結構元件
根據病毒顆粒的物理特征、RNA序列和基因組結構的差異，小RNA病毒家族的成員可分為7個主要屬，即腸道病毒、鼻病毒、心臟病毒、口瘡病毒、肝病毒和叠科病毒。脊髓灰質炎病毒(PV)、甲型肝炎病毒(HAV)、口蹄疫病毒(FMDV)、腦心肌炎病毒(EMCV)就是這個家族的典型代表[1]。MicroRNA病毒基因組由單個正鏈RNA組成，長度為7.0 kb ~8.5 kb。基因組的5’端連接壹個小病毒蛋白VPg，3’端有壹個poly(A)尾。在基因組RNA的兩端還有兩個保守的非翻譯區(UTR)。在病毒感染的早期，隨病毒RNA進入細胞的VPg被細胞蛋白酶從病毒RNA上切下。小RNA病毒基因組RNA的5′UTR為600 nt~1 300 nt，含有病毒翻譯起始所必需的內部核糖體進入位點(IRES)。基因組的編碼區包括結構蛋白區和非結構蛋白區，分為三種初級前體分子(P1、P2和P3)，其中P1前體蛋白衍生的3或4個結構蛋白構成病毒衣殼蛋白，P2和P3區構成病毒非結構蛋白。基因組的3′UTR約為50 nt ~ 100 nt，含有與病毒RNA復制和翻譯相關的3′poly(a)尾[1]。本文綜述了小RNA病毒基因表達的研究進展。
1小RNA病毒的翻譯起始
小RNA病毒進入細胞外殼後，能迅速啟動翻譯的結構特征，啟動其翻譯過程。這些病毒都具有5’UTR，可以有效利用宿主細胞的翻譯起始因子，獨立形成壹個特定的遺傳元件——IRES[2]。
1.1內部核糖體進入
小RNA病毒不依賴7？甲基鳥苷帽結構(m7帽結構)的翻譯起始機制開始翻譯過程。在病毒感染過程中，宿主細胞的翻譯機制被關閉，病毒基因可以持續表達。小RNA病毒基因組的結構特征可以阻礙宿主細胞依賴hat結構的翻譯起始機制。MicroRNA病毒基因組RNA不含m7帽結構，而M7帽結構是添加細胞mRNA帽結合復合物所必需的。病毒基因組在5’UTR有壹個不真實的起始密碼子，以防止核糖體掃描並形成IRES元件介導內部核糖體的進入，使真核核糖體可以直接與RNA翻譯起始位點結合，在真實的起始密碼子開始翻譯。宿主翻譯起始因子eIF4G是細胞中翻譯起始因子eIF4F復合物的壹個亞單位，負責與整個翻譯起始復合物中的mRNA結合。在PV感染期間，病毒3C蛋白酶切割宿主翻譯起始因子eIF4G，影響其與hat結構亞基eIF4F的結合，導致eIF4E與初始復合物中其他亞基的結合受到影響，抑制5’-末端hat結構的mRNA翻譯，從而關閉宿主細胞翻譯。PV 3C和柯薩奇病毒2A蛋白酶可以切割PABP，從而抑制宿主細胞的翻譯[3]。FMDV的前導蛋白(Lpro)可以切割eIF4G並抑制宿主細胞的翻譯[4]。然而，EMCV沒有切斷翻譯起始因子來阻斷宿主細胞的翻譯，而是改變了4E？翻譯抑制劑EP1的活性，4E？EP1能與hat結構亞單位eIF4E結合，抑制宿主細胞的翻譯。除HAV外，HAV的翻譯需要eIF4G的完全參與，病毒感染不會阻斷宿主細胞的翻譯[5]。
小RNA病毒的IRES元件的序列和二級結構在不同血清型的病毒中是保守的，這是病毒存活所必需的。根據病毒的序列相似性和結構同源性，小RNA病毒的IRES可分為三種類型，ⅰ型存在於腸道病毒和人鼻病毒中，ⅱ型存在於心臟病毒和口瘡病毒中[6]。近年來發現迪埃喬病毒屬的IRES元件序列和結構基序與ⅱ型IRES相似[7]。在肝炎病毒屬中發現了ⅲ型IRES元件。不同的IRES結構代表了不同病毒的特征，這決定了這些病毒翻譯起始的方式和速度。
參與1.2小RNA病毒翻譯的RNA元件和細胞因子
小RNA病毒5’UTR的序列和結構元件是病毒翻譯所必需的。腸道病毒和鼻病毒的5′UTR預測表明，翻譯起始位點上遊有6個主要莖環，IRES位於莖環II和V之間的區域..莖環ⅳ在病毒翻譯中起重要作用。莖環ⅳ插入三個核苷酸可導致病毒RNA的感染性丟失。莖環ⅰ (210 nt ~ 220 nt)是最大的莖環，其中GNRA的四環結構在病毒翻譯中起重要作用，在ⅱ型IRES元件中高度保守。FMDV屬於ⅱ型IRES，GNRA序列中單個核苷酸的改變可導致FMDV翻譯下調10倍[8]，可見這些序列在維持RNA三級結構的穩定性中起著重要作用。
已經鑒定了壹些與小RNA病毒的IRES元件相互作用的細胞因子，並且這些細胞因子中的壹些參與病毒翻譯的起始。狼瘡自身抗原(La)和嘧啶片段結合蛋白(PTB)兩種蛋白因子可以激活小RNA病毒的翻譯。兔網織紅細胞裂解液中細胞因子的缺乏能真實反映病毒的翻譯。在兔網織紅細胞裂解液中加入重組La可以增強和糾正異常PV的翻譯[9]。FMDV還可以使用另壹種細胞蛋白——ITAF 45。實驗表明，PTB和ITAF？45可以起到協同作用【10】。細胞翻譯起始因子也結合病毒RNA上的IRES，例如結合核糖復合物上48S和80S的eIF4B，可以與FMDV的IRES元件相互作用[11]。
在宿主細胞中，poly(C)和poly(A)的結合蛋白(即PCBP和PABP)參與復合物的形成，該復合物啟動並執行病毒基因的翻譯功能。體外實驗中，去除Hela細胞質中的PCBP2可以明顯降低PV RNA的翻譯效率，而加入重組PCBP2蛋白可以使RNA的翻譯效率恢復到刪除前的水平，證明PCBP2與PV的翻譯效率有關[12]。當PCBP2和5′UTR區的I型和II型IRES元件相互作用時，只需要I型IRES介導的翻譯。當病毒聚合酶前體3CD在細胞內積累時，3CD可以穿過病毒RNA 5’端的三葉草結構(莖環ⅰ)和PCBP？PABP？RNA復合物結合在病毒RNA復制中起作用[13]。
病毒多蛋白2的加工
2.1初級切割:2A蛋白酶和L蛋白酶。
2A蛋白酶是壹種半胱氨酸親核蛋白，與類胰凝乳蛋白酶的灰色鏈黴菌蛋白酶B [14]結構相似。小RNA病毒[1]有三種初級切割模式，其中PV、柯薩奇病毒和人鼻病毒在P1-P2前體蛋白交界處被2A蛋白酶切割，2A蛋白折疊成具有活性功能的結構，病毒蛋白以順式作用方式被切割，產生P2-P3前體蛋白和P1區多蛋白；口瘡病毒的FMDV屬於L-P1屬，L蛋白從病毒多蛋白的N端釋放。這種初級切割是L蛋白酶以順式作用方式在其自身的C末端切割。FMDV多蛋白中的2A只有16個氨基酸殘基，通過2AB自身的蛋白酶活性，與2B結合，在2A的C端被切割，形成P65436。心臟病毒和口瘡病毒的L蛋白序列同源性低，沒有蛋白水解酶活性。其L蛋白從P1前體的切割由3C蛋白酶介導。心臟病毒的初級切割由2A編碼區的NPGP肽催化，其切割下遊2A蛋白產生L-P1-2A和P1-2A。HAV多聚蛋白前體的裂解全部由3C完成。小RNA病毒感染的細胞中沒有全長的病毒多蛋白，初始切割過程與翻譯起始過程同時發生，病毒RNA和多蛋白與核糖體結合。2A蛋白酶還切割與hat依賴性翻譯起始機制相關的細胞因子[6]。當腸道病毒和鼻病毒被感染時，2A蛋白酶切割hat結合復合物的eIF4G成分，並關閉宿主細胞的翻譯。在口瘡病毒感染的早期，L蛋白在多蛋白的N-末端切割自身，釋放L蛋白酶，切割eIF4G，並誘導宿主蛋白合成的關閉。
2.2二級切割:3C蛋白
3C蛋白是病毒加工和RNA復制中的重要蛋白。它有壹個半胱氨酸作為親核作用的活性位點，其結構類似於胰凝乳蛋白酶樣色氨酸蛋白酶[15]。初次切割後，病毒蛋白3C(和3CD前體蛋白)對病毒蛋白前體進行二次切割。3C首先從P3前體蛋白上切割自己，然後在P2-P3前體蛋白之間進行重要加工，切割產生病毒復制蛋白。PV感染後，3C或3CD可以切割PABP(PABP可能幫助宿主抑制病毒翻譯)。此外，3C蛋白還能切割與真核細胞轉錄過程相關的polⅰ、polⅱ和polⅲ宿主細胞蛋白。盡管3C蛋白多肽在病毒多聚蛋白的多級加工中起重要作用，但PV的3C-D前體蛋白的活性高於成熟的3C蛋白。
2.3參與RNA復制的病毒蛋白質
在病毒多蛋白的P2區，2A蛋白酶不僅在病毒的初始加工中起重要作用，而且在病毒RNA的復制中起作用。2B蛋白可以改變細胞膜，增加細胞膜的通透性，可能在病毒感染後期病毒顆粒的釋放中起重要作用。PV RNA 2B基因的突變可產生形成缺陷空斑的突變病毒，這表明2B是PV RNA復制所必需的。2C和前體蛋白2BC是病毒誘導內膜重排和胞質小泡形成所必需的。2C能與PV負鏈RNA的3′UTR結合，提示它在正鏈RNA的合成中起重要作用。2C蛋白具有ATP酶活性，含有解旋酶基序，但不具有解旋酶活性[16]。
P3蛋白在病毒RNA復制中起著重要作用，可以幹擾宿主的免疫反應。3A蛋白能抑制ⅰ型組蛋白的表達和胞內膜的轉運，可能在小RNA病毒逃避宿主免疫反應中起重要作用，可能與病毒毒力和宿主範圍有關[17]。3B蛋白(VPg蛋白)是壹種結合正負RNA 5’端的* * *價蛋白引物。對病毒3AB蛋白的疏水區進行突變，結果表明3AB與病毒RNA的合成有關。此外，3AB還能促進病毒RNA聚合酶3D的活性，促進3CD的自我切割。3C和3CD病毒蛋白酶具有多種功能，與病毒RNA的結合、蛋白質加工和RNA復制有關。PV和柯薩奇病毒RNA 5’端的三葉草結構(莖環ⅰ)是病毒蛋白酶前體3CD的結合位點。PV中3C蛋白與RNA三葉草結構的相互作用，與宿主細胞PCBP2在RNA復制中起協同作用。RNA三葉草結構中的3CD結合位點是PV RNA復制所必需的，而不是病毒翻譯和穩定RNA結構所必需的。3D是壹種病毒RNA依賴的RNA聚合酶，在病毒RNA合成過程中，在VPg的尿嘧啶和RNA鏈的延伸中發揮作用。每個病毒模板每復制壹次，3D就有1 ~ 2個核苷酸的錯配，導致變異次數增加，進化速度加快，可能增加病毒種群的適應性[6]。
3小RNA病毒的RNA復制機制
小RNA病毒RNA復制的第壹步是合成負鏈RNA分子。在負鏈RNA的合成開始之前，正鏈RNA的翻譯必須終止。正鏈RNA翻譯關閉的機制仍不清楚。正鏈RNA和負鏈RNA的復制需要病毒自身編碼的3D復制酶，催化RNA鏈的延伸，參與病毒小蛋白VPg和普普的結合，啟動復制過程。VPg？普普作為負鏈RNA合成的引物，病毒3’端的poly(A)尾作為負鏈RNA合成的起點，啟動負鏈RNA的復制。負鏈RNA作為模板合成正鏈RNA基因組，正鏈RNA基因組被包裝在病毒顆粒中，或者作為模板合成病毒蛋白質，利用hat非依賴翻譯機制指導病毒蛋白質的合成。負鏈RNA的合成會產生雙鏈RNA(即復制RNA，RF)[1]。在VP感染的細胞中，正鏈RNA與負鏈RNA的比例約為50∶1，這表明單個負鏈RNA可以作為模板合成多個正鏈RNA，形成RF的壹部分[6]。
3.1 RNA復制所需的病毒RNA元件和細胞蛋白質
細小病毒5′UTR的壹些RNA序列和二級結構是病毒RNA復制所必需的[18]。腸道病毒和鼻病毒的5’-末端三葉草結構是病毒蛋白3CD和宿主蛋白PCBP的結合位點，3CD結合到三葉草結構的D環，宿主蛋白PCBP2結合到B環。3CD和PCBP2結合三葉草結構後與病毒RNA形成三聯體，在RNA復制中發揮作用。從細胞質提取物中去除PCBP2蛋白可以減少PV RNA的合成，這表明PCBP2是病毒RNA復制所必需的。細胞蛋白PABP結合到病毒的3’-末端poly(A)尾，然後與病毒蛋白3CD和結合到5’-末端三葉草結構的細胞蛋白PCBP2相互作用。因此，通過PABP與PCBP2的相互作用，5’和3’端的病毒RNA可能相互作用，促進病毒復制的啟動[19]。PV的3AB和3CD相互作用，與病毒的三葉草結構相互作用，影響病毒RNA的復制。
小RNA病毒基因組的編碼區含有壹個保守的RNA發夾結構——順式作用復制元件(cre)。發夾結構由AAACA序列組成，突變試驗證實cre序列是病毒RNA復制所必需的。AAACA序列中單個核苷酸的取代阻礙了環狀基序的形成，環狀基序可以終止病毒RNA復制並導致病毒死亡[20]。CRE結構已在人鼻病毒、PV和心臟病毒中被鑒定，它們位於基因組ORF的不同位置，而FMDV的CRE結構位於基因組的5’UTR區[20]。Cre可用作病毒復制蛋白的結合位點，其在病毒RNA復制中起作用，也可用作VPg多尿的模板。突變分析表明，cre的多尿只涉及正鏈RNA的合成，負鏈RNA的合成可能利用poly(A) tail進行多尿和初始復制[21]。3CD與cre、三葉草結構與RNA的相互作用導致病毒RNA的5’端和3’端相互作用，導致病毒RNA的結構重排，有利於RNA的有效復制。
3.2病毒正鏈和負鏈的RNA合成
正鏈RNA的復制始於負鏈RNA介導的3’端，在此處二級和三級結構可能解開，RNA鏈延伸。PV RNA的2C蛋白雖然沒有解旋酶活性，但2C蛋白與負鏈RNA的3’端結合，發揮ATP酶活性。此外，RNA聚合酶3D是壹種松散的雙RNA，在病毒RNA合成中起到解旋酶的作用[22]。細胞蛋白質也參與病毒RNA起始復合物的形成，並且已經鑒定了壹些與病毒RNA結構相互作用的細胞蛋白質。在PV感染的細胞中發現了壹種能與正鏈RNA的3′UTR相互作用的細胞蛋白，HNRNP C蛋白。該蛋白結合位點RNA的缺失或突變導致RNA合成和病毒存活減少[23]。
負鏈RNA的合成存在爭議。壹種模型認為，病毒與PABP末端的三葉草結構、poly(A)和PCBP3CD 5 '相互作用，病毒RNA形成環化分子後開始負鏈RNA的合成[24]。因為病毒負鏈RNA是在細胞質中合成的，所以細胞質中既有細胞mRNA，也有poly(A)尾。小RNA病毒必須建立壹種能保證聚合酶識別病毒RNA的機制。在cre環中有壹個保守的AAACA基序，該基序的前兩個A是合成VPgpU和VPgpUpU的模板，後者啟動病毒復制[25]。另壹種模式認為負鏈RNA的合成始於基因組的poly(A)尾。在這個模型中，宿主相關的酶，如末端轉移酶，在病毒基因RNA的3’端添加壹個poly(U)，這個poly(U)是反向的，與病毒RNA上的poly(A)互補，形成發夾結構，可以作為復制引物合成負鏈RNA[6]。
4結論
目前，關於小RNA病毒基因表達的壹些問題還不清楚。屬於MicroRNA病毒家族的病毒在遺傳機制上高度保守。研究MicroRNA病毒的基因表達機制可以為治療這些病毒引起的疾病和減少經濟損失提供潛在的幫助，也可以為研究真核生物的基因表達調控提供參考材料。