壹、微量凱氏定氮法
樣品用濃硫酸加熱。含氮有機物分解產生氨(消化)，氨與硫酸反應生成硫酸銨。堿化後分解釋放出氨，用蒸汽將氨蒸成酸性溶液。根據這種酸性溶液的中和程度，可以計算出樣品的氮含量。
二、縮二脲法(縮二脲法)？
1，實驗原理
縮二脲是兩分子尿素在180℃左右加熱，釋放出壹分子氨的產物。在強堿性溶液中，縮二脲與硫酸銅生成紫色絡合物，稱為縮二脲試驗。任何具有兩個酰胺基團或兩個直接相連的肽鍵，或由中間碳原子連接的肽鍵的化合物，都有縮二脲試驗。？
紫色絡合物的顏色與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量和氨基酸組成無關，因此可以用來測定蛋白質的含量。測量範圍為1-10毫克蛋白質。幹擾該測定的主要物質是硫酸銨、tris緩沖液和壹些氨基酸。？
這種方法的優點是速度快，不同蛋白質產生的顏色深淺相似，幹擾物質少。主要缺點是靈敏度差。因此，雙縮脲法通常用於需要快速但不是非常準確的蛋白質測定。
2.試劑和設備？
(1)試劑:A .標準蛋白溶液:由標準結晶牛血清白蛋白或標準酪蛋白配制成10mg/ml的標準蛋白溶液，其純度可用bsa濃度為1mg/ml的a280校正為0.66。
如果需要，標準蛋白也可以預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算其純度，然後根據其純度稱量配制標準蛋白溶液。用0.9%nacl和0.05n nach制備牛血清白蛋白和酪蛋白。？
b、縮二脲試劑:稱取1.50g硫酸銅和6.0g酒石酸鉀鈉，溶於500ml水中，邊攪拌邊加入300ml 10% NaOH溶液，用水稀釋至1l，貯存於塑料瓶(或內壁塗有石蠟的瓶)中。這種試劑可以保存很長時間。如果儲存瓶中出現黑色沈澱，則需要重新配制。
(2)設備:可見光分光光度計、15大試管、渦旋混合器等。
3、操作方法
(1)標準曲線的測定:將12試管分成兩組，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml標準蛋白溶液，用水補足至1 ml，再加入4 ml雙縮脲試劑。充分搖勻後，室溫(20 ~ 25℃)放置30分鐘，於540nm處進行比色測定。
第壹個沒有蛋白質溶液的試管用作空白對照溶液。取兩組測量值的平均值，以蛋白質含量為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。
(2)樣品的測定:取2 ~ 3支試管，用與上述相同的方法測定未知樣品的蛋白質濃度。註意，樣品濃度不應超過10mg/ml。？
三、福林—-酚試劑法(lowry法)？
1，實驗原理？
這種蛋白質方法是最靈敏的方法之壹。在過去，這種方法是應用最廣泛的方法。近年來，由於試劑B(現已可訂購)制備困難，逐漸被考馬斯亮藍法取代。該方法的顯色原理與雙縮脲法相同，只是加入了第二試劑福林—-酚試劑，增加了顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。
這兩種顏色反應之所以產生深藍色，是因為在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合形成絡合物。福林—酚試劑中的磷鉬酸-磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深藍色(鉬藍和鎢藍的混合物)。
在壹定條件下，藍色的深淺與蛋白質的多少成正比。福林—酚試劑法首先由lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。它將在未來的生物化學領域得到廣泛的應用。這種方法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多。缺點是耗時長，標準曲線不是嚴格的線性，特異性差，幹擾物質多。
幹擾縮二脲試驗的離子也容易幹擾勞裏反應。而且對後者的影響要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖、甘油均有幹擾作用。
低濃度的尿素(0.5%)、硫酸鈉(1%)、硝酸鈉(1%)、三氯乙酸(0.5%)、乙醇(5%)、乙醚(5%)和丙酮(0.5%)對顯色沒有影響，但這些物質的濃度較高。
含硫酸銨的溶液只能通過加入濃碳酸鈉-氫氧化鈉溶液來測定。如果樣品酸度高，顯色後顏色會變淺，碳酸鈉-氫氧化鈉溶液的濃度必須提高1 ~ 2倍。？
在測定過程中，加入福林-酚試劑時要特別小心，因為試劑只在酸性ph下穩定，但上述還原反應只在ph=10時發生。因此，在堿性銅-蛋白溶液中加入福林-酚試劑時，必須立即混合，這樣才能在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前發生還原反應。
該方法也適用於酪氨酸和色氨酸的定量測定。該方法可檢測的最小蛋白質質量為5毫克。通常測定範圍為20 ~ 250毫克。
2、試劑和設備
(1)試劑
A、試劑A: (a)碳酸鈉10g，NaOH 2g，酒石酸鉀鈉0.25g。溶解在500毫升蒸餾水中。(b)將0.5g硫酸銅溶於100ml蒸餾水中，每次使用前，將50份(A)和1份(b)混合，得到試劑A..？
B、試劑B:將100g鎢酸鈉、25g鉬酸鈉和700ml蒸餾水、50m l 85%磷酸和100ml濃鹽酸加入2升地面回流瓶中，充分混合，連接回流管，小火回流10h，回流結束時加入65438+。
開口持續沸騰15分鐘，以驅除過量的溴。冷卻後，溶液呈黃色(如果還是綠色，必須重復滴加液溴的步驟)。稀釋至1L，過濾，並將濾液儲存在棕色試劑瓶中。使用時用標準nach滴定，酚酞作指示劑，然後適當稀釋，加入約1倍的水，使最終酸濃度約為1n。？
c標準蛋白溶液:準確稱取結晶的牛血清白蛋白或球蛋白，溶於濃度約為250mg/ml的蒸餾水中。如果牛血清白蛋白在水中渾濁，可用0.9%nacl溶液代替。？
(2)設備？
壹、可見光分光光度計？
b、渦流混合器？
c、秒表？
d、16試管？
3、操作方法
(1)標準曲線的測定:取16支大試管，1為空白，3支為未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，1.0 ml標準。加水至1.0毫升，
然後，在每個試管中加入5ml試劑A，在渦旋混合器上快速混合，並在室溫(20 ~ 25℃)下放置65438±00分鐘。然後逐壹加入0.5 ml試劑B(福林—酚試劑)，立即混勻。
這壹步攪拌速度要快，否則顯色程度會減弱。然後在室溫下靜置30分鐘，取第壹管無蛋白溶液作為空白對照，在700nm處測量每管中溶液的吸光度值。以蛋白質的量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。？
註意:由於lowry反應的顯色隨時間加深，操作時間必須精確控制，即在第1支試管中加入5ml試劑A後開始計時，1min後，在第二支試管中加入5ml試劑A，2min後加入第三支試管，以此類推。
如果從試劑A被添加到所有試管已經超過10分鐘，則可以立即將0.5 ml試劑B添加到1試管，在1分鐘後將0.5 ml試劑B添加到第二個試管，在2分鐘後添加到第三個試管，以此類推。試劑加到最後壹個試管後，再靜置30分鐘，然後開始測吸光。
每分鐘測量壹個樣本。為了防止多管操作時出錯，每個學生必須提前在實驗記錄本上畫出下表。要添加到每個試管中的量(ml)如表中所示，按照從左到右和從上到下的順序逐管添加。下面兩行是每個試管中蛋白質的計算量(微克)和測得的吸光度值。
福林酚試劑法實驗表。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10標準蛋白00.10.20 . 40.81.0(250mg/ml)未知蛋白0.2 0.4 0.6(約250mg/ml)？
蒸餾水1 . 00 . 90 . 80 . 60 . 200 . 80 . 60 . 4試劑A 5 . 05 . 05 . 05 . 05 . 05 . 05 . 05 . 0試劑B 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白質的吸光度值(a700)？
(2)樣品的測定:取1 ml樣品溶液(含蛋白質約20~250微克)，按上述方法操作，取1 ml蒸餾水代替樣品作為空白對照。
通常，樣品的測定也可以與標準曲線的測定壹起進行。即在標準曲線確定的每個試管後面加三個試管。上表中的8、9和10試管。？
根據被測樣品的吸光度值，在標準曲線上找出相應的蛋白質質量，從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度。？
註:由於各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顏色的深淺往往隨著蛋白質的不同而不同。因此，這種方法通常只適用於測定蛋白質的相對濃度(相對於標準蛋白質)。
4.改進的簡單福林-酚試劑法？
1，試劑？
(1)試劑A:堿性銅試劑溶液含有0.5n氯化鈉、10%碳酸鈉、0.1%酒石酸鉀和0.05%硫酸銅。配制時註意用少量蒸餾水溶解硫酸銅後再加入。
(2)試劑B:同前面的基本法。使用時，加入蒸餾水稀釋8倍。
(3)標準蛋白溶液:同基本法。？
2.操作步驟測定標準曲線和樣品溶液的操作方法同《基本法》。只有試劑A換成1毫升，試劑B在室溫下靜置10分鐘後換成4毫升。在55℃恒溫水浴中保溫5分鐘。
用自來水冷卻後，在660nm處測量吸光度。改進後的快速簡便方法可獲得接近福林—酚試劑法(勞裏基本定律)的結果。？
5.考馬斯亮藍法(布拉德福法)？
1，實驗原理雙縮脲法(Biret法)和福林—酚試劑法(lowry法)的明顯缺點和諸多局限性，促使科學家們尋找更好的測定蛋白質溶液的方法。？
bradford在1976建立的考馬斯亮藍法(bradford法)是根據蛋白質與染料結合的原理設計的。這種蛋白質方法與其他方法相比具有突出的優點，因此被廣泛應用。
這種方法是目前最靈敏的蛋白質方法。考馬斯亮藍g-250染料在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰(lmax)位置從465nm變為595nm，溶液顏色從棕黑色變為藍色。
認為染料主要與蛋白質中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基結合。在595nm處測量的吸光度值a595與蛋白質濃度成正比。
2.試劑和設備？
(1)試劑:？
a、標準蛋白溶液，用球蛋白或牛血清白蛋白，配制成65438±0.0毫克/毫升和0.65438±0毫克/毫升標準蛋白溶液。
B.考馬斯亮藍G-250染料試劑:稱取100mg考馬斯亮藍G-250，溶於50ml 95% 95%乙醇中，然後加入120ml 85%磷酸，用水稀釋至1升。
(2)裝備:？
壹、可見光分光光度計？
b、渦流混合器？
c，16試管？
3、操作方法
(1)標準方法？
a、取16支試管，1為空白，3支為未知樣品，其余試管分為兩組，按表中順序分別加入樣品、水和試劑，即每支試管中加入0、0.01、0.02和0.04的1.0mg/ml標準蛋白溶液。
最後，在每支試管中加入5.0ml考馬斯亮藍G-250試劑，每支試管加入後立即在渦旋混合器上混合(註意不要太劇烈，以免產生大量難以消除的氣泡)。有關未知樣本的樣本量，請參見下表中的8、9、10號試管。？
b、加入試劑後2-5分鐘，用分光光度計測定各樣品在595nm處的吸光值a595，空白對照為1號試管，即0.1ml水和5.0 mg-250試劑。？
註意:不要使用應時比色皿(因為不容易洗掉染料)。使用塑料或玻璃比色皿，並在使用後立即用少量95%的乙醇清洗，以洗掉染料。塑料比色皿不應長時間浸泡在乙醇或丙酮中。？
考馬斯亮藍法實驗表管數1 2 3 4 5 6 7 8 9 10標準蛋白00.01 0.020 . 060 . 080.10(1.0mg/ml)未知蛋白0.02 0.04 0.06(約65438)。
蒸餾水0.1.09 0.08 0.06 0.04 0.020 0.08 0.06 0.04考馬斯亮藍G-250試劑5.05 . 05.05 . 05.05 . 05.05 . 05.0每管中蛋清質量(mg)，吸光值(a595)？
c .以標準蛋白質量(mg)為橫坐標，吸光度值a595為縱坐標，繪制得到標準曲線。從這條標準曲線上，可以根據未知樣品測得的a595值查出未知樣品的蛋白質含量。0.5mg牛血清白蛋白/ml溶液的a595約為0.50。？
(2)當樣品中蛋白質濃度較低時(10-100 mg/ml)，可將取樣量(包括補充水)增加到0.5ml或1.0ml，空白對照分別為0.5ml或1.0ml水，考馬斯亮藍G-20。0.05毫克牛血清白蛋白/毫升溶液的a595約為0.29。